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Zellzählung von Mesenchymalen Stammzellen für die regenerative Medizin

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Zellzählung von Mesenchymalen Stammzellen

für die regenerative Medizin

Die Verwendung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) für allogene und autologe Zelltherapien ist äußerst interessant, jedoch erweist sich die Bestimmung der Zellzahl und der Viabilität als schwierig. Hierbei erlauben die Nucleocounter® Geräte eine präzise und robuste Zellzahlbestimmung von primären MSCs, z.B. aus dem Fettgewebe oder aus dem Knochenmark. Die Probenvorbehandlung, Färbung und auch das Laden der Zählkammer wird durch die Via1-Cassette™ in einem einzigen Schritt kombiniert, robuste und konsistente Ergebnisse können somit gewährleistet werden. Vor allem Anwender im GMP-Bereich profitieren von der Einfachheit und den reproduzierbaren Ergebnissen.

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Die Bedeutung von mesenchymalen Stammzellen für regenerative Therapien

MSCs werden oftmals für die Behandlung  von verschiedenen Krankheiten eingesetzt, wobei die häufigsten Einsatzgebiete Erkrankungen des Blutes, des Skelettmuskels oder Knochen- und Herzerkrankungen darstellen. Diese Zellen können direkt von dem betroffenen Patienten (autolog) oder von einem genetisch unterschiedlichen Patienten (allogen) gewonnen werden. Das große Interesse an MSCs beruht auf der Tatsache, dass MSCs in verschiedene Zellen ausdifferenziert werden können, darunter Knochen-, Fett-, Knorpel- und Muskelzellen sowie Neuronen1-3. Somit kommen Sie immer häufiger für die Verwendung in regenerativen Therapien in Betracht. Die klinischen Anwendungen der Transplantation von MSCs reichen von Geweberegeneration4, 5  bis hin zu Immuntherapien6, z.B. die Graft-Versus-Host-Reaktion. Weiterhin sekretieren MSCs verschiedene apoptotische und angiogene Zytokine und Wachstumsfaktoren, welche den Heilungsprozess nach einem Herzinfarkt7 oder bei der Wundheilung8 unterstützen können. Diese Zellpopulation kann relativ einfach aus Knochenmarkaspiraten, Fettgewebe, Nabelschnurblut, Plazentagewebe und wharton´s jelly isoliert werden (Abbildung 1).

Zelltherapie

Abbildung 1. MSCs für allogene und autologe Stammzelltherapien. MSCs können aus der stromal-vaskulären Fraktion (SVF) nach einer Liposuktion oder aus Knochenmarkaspiraten gewonnen werden. Die MSCs werden direkt oder erst nach vorheriger Expansion und Lagerung für autologe und allogene Stammzelltherapien verwendet. Während des gesamten Produktionsprozesses können die Zellzahl und die Viabilität mit den NucleoCounter® Geräten präzise bestimmt werden.

Akkurate Zellzahlbestimmung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe

Adipogene MSCs können sehr einfach aus der stromal-vaskulären Fraktion (SVF) nach einer Fettbiopsie oder einer Liposuktion isoliert werden9-11. Die SVF enthält verschiedene Zellen, darunter MSCs, Stromazellen, Endothelzellen, Adipozyten, Erythrozyten, jedoch auch Fetttröpfchen und Mizellen12. Für Stammzelltherapien wird diese Fraktion oftmals direkt verwendet, eher selten werden die Zellen weiterkultiviert. Hierbei ist es äußerst wichtig, die Zellzahl und Viabilität der Zellpopulation im Vorfeld akkurat zu bestimmen. Viele Zellzählgeräte können jedoch nicht zwischen Zellen und Zellfragmenten unterscheiden  oder variieren stark zwischen den Anwendern. Um dieses Problem zu umgehen, können die NucleoCounter® Geräte für eine präzise Zellzahlbestimmung von adipogenen MSCs verwendet werden13-18.

Für die Bestimmung der Gesamtzellzahl aus der SVF mit den NucleoCounter® Geräten wird die Zellsuspension mit Solution 10 (optional: Reagent A100 und B) vorbehandelt, wodurch Zellen und andere Partikel lysiert werden. Die Zellkerne werden anschließend mit DAPI angefärbt, z.B. mit Hilfe der Via1-Cassette™ (Abbildung 2). Die SVF enthält neben nukleären Zellen auch Zelltrümmer, Mizellen, Mikrovesikel oder Fetttröpfchen sowie Zellen ohne Zellkern, z.B. Erythrozyten und Thrombozyten. Da DAPI spezifisch an DNA bindet, werden mit den NucleoCounter® Geräten nur nukleäre Zellen gezählt.

SVF

Abbildung 2. Präzise Bestimmung der Zellzahl und der Viabilität aus der stromal-vaskulären Fraktion (SVF). Neben verschiedenen Zellen enthält die SVF auch Verunreinigungen, wie z.B. Mizellen, Fetttröpfchen, Erythrozyten und Mikrovesikel, welche die Zellzählung beeinflussen können. Die Vorbehandlung mit Solution 10 (optional: Reagent A100 und B) lysiert alle Zellen und Partikel. Durch DAPI werden anschließend die Zellkerne angefärbt und die Gesamtzellzahl mit den NucleoCounter® Geräten bestimmt. In einem zweiten Schritt werden die Zellkerne der toten Zellen ohne Vorbehandlung angefärbt.

 

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Präzise Zellzahlbestimmung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark

MSCs können aus Knochenmarkbiopsien oder Knochenmarkaspiraten gewonnen werden19,20. Die Bestimmung der Zellzahl und der Viabilität von MSCs direkt aus dem Knochenmark ist schwierig, da die Proben viele Erythrozyten enthalten diese und bei herkömmlichen automatisierten und manuellen Zellzählungen stören. Zur einfachen und glaubwürdigen Bestimmung von MSCs direkt aus Knochenmarkaspiraten21,22 bieten die NucleoCounter® Geräte eine schnelle Methode an, um auch Proben mit vielen Erythrozyten präzise auszählen zu können (Abbildung 3). Durch Zugabe eines Erythrozyten Lysepuffers zu der Knochenmarkprobe werden die Erythrozyten lysiert und das Hämoglobin verdünnt. Anschließend wird die Zellprobe mit den zwei Fluorophoren Acridinorange und DAPI angefärbt und analysiert.

Knochenmark

Abbildung 3: Einfache Zellzählung von nukleären Zellen in Knochenmarkaspiraten. Durch eine kurze Inkubation der Knochenmarkprobe mit Solution 17 werden die Erythrozyten lysiert und anschließend die nukleären Zellen mit Acridinorange (alle Zellen) sowie DAPI (nur die toten Zellen) angefärbt. Die nukleären Zellen werden mit Hilfe der  NucleoCounter® Geräte detektiert.

 

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Einfaches Datenmanagement und geeignet für den GMP-Bereich

Die nutzerfreundliche NucleoView™ Software zeigt automatisch die Viabilität, Gesamtzellzahl, Anzahl an lebenden und toten Zellen an. Weiterhin erlaubt die NucleoView™ Software auch eine visuelle Inspektion des Fluoreszenzbildes und die Möglichkeit, das Zellzählergebnis zu verifizieren. Die NucleoCounter® Geräte  sind geeignet für den Einsatz im GMP-Bereich und unter 21 CFR Part 11 Regulatorien (Abbildung 4).  Die einfache Handhabung der einzigarten Via1-Cassette™ gewährleistet eine konsistente Probennahme. Das Volumen der Via1-Cassetten™ ist kalibriert und die eingebaute Pipetten-Funktion verhindert anwenderspezifische Fehler beim Mischen und Laden der Zellprobe. All dies summiert sich in eine präzise und reproduzierbare Zellzählung, welche die Trypanblau-Zellzählung bei weitem übertrifft.

Nucleocounter

Abbildung 4. Der NucleoCounter® NC-200™ implementiert unter 21 CFR Part 11. Verschiedene Möglichkeiten der Dokumentation, z.B. elektronische und handschriftliche Signaturen sowie IQ/OQ/PQ Protokolle, ein kalibriertes Gerät und adaptierbare Protokolle gewährleisten eine glaubwürdig und reproduzierbare Bestimmung der Zellzahl und Viabilität.

 

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Literatur

  1. Dominici, M., et al., Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006. 8(4): p. 315-317.
  2. Makino, S., et al., Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. Journal of Clinical Investigation, 1999. 103(5): p. 697-705.
  3. Arthur, A., et al., Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells, 2008. 26(7): p. 1787-1795.
  4. Horwitz, E.M., et al., Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: implications for cell therapy of bone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002. 99(13): p. 8932-8937.
  5. Kawada, H., et al., Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Blood, 2004. 104(12): p. 3581-3587.
  6. Zhao, K., et al., Immunomodulation effects of mesenchymal stromal cells on acute graft-versus-host disease after hematopoietic stem cell transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation, 2015. 21(1): p. 97-104.
  7. Hahn, J.-Y., et al., Pre-treatment of mesenchymal stem cells with a combination of growth factors enhances gap junction formation, cytoprotective effect on cardiomyocytes and therapeutic efficacy for myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology, 2008. 51(9): p. 933-943.
  8. Schnabel, L.V., et al., Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research, 2009. 27(10): p. 1392-1398.
  9. Zuk, P.A., et al., Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell, 2002. 13(12): p. 4279-4295.
  10. Mizuno, H., M. Tobita, and A.C. Uysal, Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells, 2012. 30(5): p. 804-810.
  11. Gimble, J.M., A.J. Katz, and B.A. Bunnell, Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research, 2007. 100(9): p. 1249-1260.
  12. Astori, G., et al., „In vitro“ and multicolor phenotypic characterization of cell subpopulations identified in fresh human adipose tissue stromal vascular fraction and in the derived mesenchymal stem cells. Journal of Translational Medicine, 2007. 5: p. 55-55.
  13. Kølle, S.-F.T., et al., Enrichment of autologous fat grafts with ex-vivo expanded adipose tissue-derived stem cells for graft survival: a randomised placebo-controlled trial. The Lancet, 2013. 382(9898): p. 1113-1120.
  14. Araña, M., et al., Preparation and characterization of collagen-based ADSC-carrier sheets for cardiovascular application. Acta Biomaterialia, 2013. 9(4): p. 6075-6083.
  15. Kazantseva, J., et al., Alternative splicing targeting the hTAF4-TAFH domain of TAF4 represses proliferation and accelerates chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. PLoS ONE, 2013. 8(10): p. e74799.
  16. Choi, J.S., et al., In vitro expansion of human adipose-derived stem cells in a spinner culture system using human extracellular matrix powders. Cell and Tissue Research, 2011. 345(3): p. 415-423.
  17. Suga, H., et al., IFATS collection: Fibroblast growth factor-2-induced hepatocyte growth factor secretion by adipose-derived stromal cells inhibits postinjury fibrogenesis through a c-Jun N-terminal kinase-dependent mechanism. Stem Cells, 2009. 27(1): p. 238-249.
  18. Miyazaki, T., et al., Isolation of two human fibroblastic cell populations with multiple but distinct potential of mesenchymal differentiation by ceiling culture of mature fat cells from subcutaneous adipose tissue. Differentiation, 2005. 73(2): p. 69-78.
  19. Meirelles, L.d.S., P.C. Chagastelles, and N.B. Nardi, Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. Journal of Cell Science, 2006. 119(11): p. 2204-2213.
  20. Kuznetsov, S.A., et al., Circulating skeletal stem cells. The Journal of Cell Biology, 2001. 153(5): p. 1133-1140.
  21. Heathman, T.R.J., et al., Expansion, harvest and cryopreservation of human mesenchymal stem cells in a serum-free microcarrier process. Biotechnology and Bioengineering, 2015. 112(8): p. 1696-1707.
  22. Heathman, T.R.J., et al., Serum-free process development: improving the yield and consistency of human mesenchymal stromal cell production. Cytotherapy, 2015. 17(11): p. 1524-1535.

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