Geheimnisse preisgeben: Wie man zellen mit einem hämozytometer zählt

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Ein Hämozytometer (auch als Hämozytometer oder Zellzählkammer bekannt) ist ein Gerät, das für die manuelle Zellzählung verwendet wird. Wie der Name schon sagt, wurde das Hämozytometer ursprünglich für die Quantifizierung von Blutzellen erfunden.¹ Heute werden Hämozytometer zur Bestimmung der Gesamtzellzahl und der Zellviabilität vieler verschiedener Zelltypen in unterschiedlichen Anwendungen eingesetzt.
In diesem Blog-Beitrag beantworten wir häufige Fragen zu Hämozytometern, darunter:

Was sind Hämozytometer und wie funktionieren sie?
Wie zähle ich Zellen mit einem Hämozytometer?
Welche Regeln und Strategien sollte ich bei der manuellen Zellzählung anwenden?
Wie berechne ich Verdünnungsfaktor, Zellzahl und Zellviabilität?
Auf welche häufigen Fehler bei der Zellzählung sollte ich achten?

Drei verschiedene Hämozytometer aufgereiht: Bürker (oben), Thoma neu (Mitte) und Türk (unten).

Was sind hämozytometer und wie funktionieren sie?

Abbildung zeigt die Komponenten eines Hämozytometers und die Struktur des Gitters einer Neubauer-Kammer.

Ein Hämozytometer ist ein spezieller Objektträger, der für die Zellzählung mit einem Mikroskop verwendet wird. Es gibt verschiedene Arten von Hämozytometern, alle mit unterschiedlichen Zählrastern. Am gebräuchlichsten ist die „Improved Neubauer“-Kammer.

Die improved neubauer-kammer

Der Improved Neubauer hat in der Mitte des Objektträgers eine H-förmige Vertiefung, die den Raum in zwei Zählkammern trennt. Auf der Oberfläche sind Raster eingraviert, die die Zellzählung einfacher und präziser machen.

Das 3×3 mm große Zählraster der Improved Neubauer ist in neun 1×1 mm große Quadrate unterteilt. Wie im Diagramm dargestellt, ist jedes Quadrat weiter in 16, 100 oder 400 kleinere Quadrate unterteilt. Die verschiedenen Raster ermöglichen es Ihnen, Zellen unterschiedlicher Größe zu zählen.

Wie man zellen mit einem hämozytometer zählt

Bevor Sie mit der Zellzählung mit Ihrem Hämozytometer beginnen, müssen Sie einige Vorbereitungen treffen. Beginnen Sie mit der Entnahme einer repräsentativen Probe Ihrer Zellpopulation. Sie können sicherstellen, dass Ihre Probe repräsentativ ist, indem Sie die Lösung durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren vor der Probenentnahme resuspendieren.

Wenn Sie nicht nur die Gesamtzahl der Zellen, sondern auch die Zellviabilität bestimmen möchten, können Sie einen Farbstoffausschlusstest durchführen. Dabei werden Ihre Zellen mit einem Farbstoff angefärbt, der zwischen lebensfähigen und nicht-lebensfähigen Zellen unterscheiden kann. Einige häufig verwendete Färbemittel sind Trypanblau, Propidiumjodid, Erythrosin B, Acridinorange und 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI). In unserem früheren Blogbeitrag erfahren Sie mehr über diese Färbungen, einschließlich ihrer Eigenschaften, Vorteile und Nachteile.

Sie müssen ihre zellen möglicherweise verdünnen

Wenn sich zu viele oder zu wenige Zellen in Ihrer Zählkammer befinden, wirkt sich dies auf Ihre Zellzahl aus. Wenn es zu viele Zellen gibt, kann das Zählen schwieriger sein und zu Fehlern führen. Sie können jedoch mit mehr Zufallsfehlern rechnen, wenn es zu wenige Zellen gibt. Die empfohlene Zellkonzentration für die Zählung mit einem Hämozytometer liegt bei 106 Zellen/ml. Bei Verwendung einer verbesserten Neubauer-Kammer liegt der optimale Zellkonzentrationsbereich bei 2,5 × 105 bis 2,5 × 106 Zellen/ml.² Daher müssen Sie Ihre Probe vor dem Zählen möglicherweise verdünnen oder konzentrieren.

Wenn Sie Ihre Zellen verdünnen, notieren Sie sich den Verdünnungsfaktor, damit Sie später die Konzentration der Zellen in der ursprünglichen Probe berechnen können. Die Bestimmung des Verdünnungsfaktors ist mit der folgenden Formel einfach:

Verwendung ihres hämozytometers

Kurz gesagt, die Hämozytometer-Methode zur Zellzählung umfasst die folgenden Schritte: ²

Reinigen Sie das Hämozytometer und das Deckglas mit Ethanol. Achten Sie darauf, dass das Ethanol vollständig verdampft, damit es Ihre Zellen nicht beeinträchtigt.
Legen Sie das Deckglas auf die Kammern des Hämozytometers, damit Ihre Probe nicht verdunstet.
Beladen sie eine oder beide Zählkammern mit 10 µl Ihrer gefärbten Probe mit einer Mikropipette. Die Kapillarwirkung sorgt für eine gleichmäßige Verteilung der Suspension in der Kammer.
Legen Sie das Hämozytometer unter das Mikroskop.
Stellen Sie den Fokus des Mikroskops so ein, dass Sie die Zellen deutlich sehen können.
Zählen Sie die Zellen mit einem Zählgerät (siehe unten für Details zu den Regeln der Zellzählung mit einem Hämozytometer). Behalten Sie die Gesamtzahl der Zellen und die Anzahl der toten Zellen im Auge.
Wenn Sie fertig sind, reinigen Sie das Hämozytometer und das Deckglas mit Ethanol.

Regeln zur zellzählung mit einem hämozytometer

Die Regeln und Strategien für die Zellzählung mit einem Hämozytometer können von Person zu Person und von Labor zu Labor variieren. Bevor Sie die Zellen im Raster Ihres Hämozytometers zählen, sollten Sie entscheiden, welche Quadrate Sie zählen werden und welche Regeln Sie anwenden, um zu vermeiden, dass dieselbe Zelle zweimal gezählt wird. Um präzise und verlässliche Ergebnisse zu erzielen, ist es unerlässlich, dass Sie sich konsequent an die von Ihnen gewählte Strategie halten – wählen Sie also sorgfältig!

Welche quadrate soll ich zählen?

Vor dem Zählen müssen Sie entscheiden, welche Quadrate des Hämozytometer-Zählrasters Sie zählen wollen. Die Auswahl von Quadraten, die eine gute Gesamtdarstellung der Zellen auf dem Objektträger ergeben, ist entscheidend. Vermeiden Sie es zum Beispiel, nur die Zellen in den obersten drei Quadraten des Rasters zu zählen, da dies möglicherweise nicht repräsentativ ist, wenn sich die Flüssigkeit bei der Abgabe aus der Pipette nicht gleichmäßig über die gesamte Objektträgeroberfläche verteilt hat. Einige gängige Strategien, die von unseren internen Wissenschaftlern berichtet werden, sind:

Basierend auf den Ansichten unseres hauseigenen Field Application Scientist-Teams haben wir festgestellt, dass diese drei Methoden am häufigsten verwendet werden:

Bei der logischen Zellzählstrategie zählen Sie Zellen in den grün gefärbten Bereichen, d.h. den vier Eckquadraten und dem mittleren Quadrat des Hämozytometer-Gitters.

Die logische zählung

Ein gängiger und repräsentativer Ansatz ist die Zählung der Zellen in den vier Eckquadraten und dem mittleren Quadrat des Rasters des Hämozytometers. Dies wird als „logische Zählung“ bezeichnet.

Die absolute zählung

Alternativ können Sie auch die Zellen in allen neun Quadraten des Hämozytometers zählen. Bei dieser als „absolute Zählung“ bekannten Methode zählen Sie die Zellen in allen Quadraten, während Sie einem Zickzackmuster folgen. Diese Zählmethode ist vorteilhaft, wenn die Zellkonzentration in der Probe hoch ist, denn es handelt sich um ein Muster, dem man leicht folgen kann, so dass man sich nicht so leicht verirrt und neu beginnen muss.²

Bei der absoluten Zellzählstrategie zählen Sie die Zellen in den grün gefärbten Bereichen, d.h. alle Quadrate, während Sie einem Zick-Zack-Muster und der oberen und rechten Grenze des Hämozytometer-Gitters folgen.

Bei der schnellen Zellzählungsstrategie zählen Sie Zellen in den grün gefärbten Bereichen, d.h. den beiden gegenüberliegenden Eckquadraten des Hämozytometer-Gitters.

Die schnellzählung

Und schließlich, wenn Sie in Eile sind, könnten Sie versucht sein, die „Schnellzählung“ durchzuführen. Bei dieser Methode zählen Sie nur die Zellen in zwei sich diagonal gegenüberliegenden Quadraten. Wenn Sie diesen Ansatz wählen, werden Ihre Ergebnisse nicht so repräsentativ sein, aber es kann eine gute Möglichkeit sein, Ihre Zellkultur stichprobenartig zu überprüfen, wenn Sie in Eile sind.

Welche zellen befinden sich innerhalb des zählquadrats?

Regeln darüber, welche Zellen als innerhalb eines Quadrats gezählt werden, sorgen dafür, dass Sie dieselbe Zelle nicht zweimal zählen. Einige Labore schließen die Zellen ein, die den oberen und den rechten Rand des Rasters berühren, und schließen die Zellen aus, die den unteren und den linken Rand des Rasters berühren (siehe Diagramm). Andere Labore verwenden andere Regeln, fragen Sie also Ihre Kollegen, wenn Sie sich nicht sicher sind.

Unabhängig von der von Ihnen gewählten Strategie ist es am wichtigsten, dass Sie bei der Zählung konsequent vorgehen,² damit Ihre Ergebnisse so genau wie möglich sind und Sie Ihre Daten im Laufe der Zeit vergleichen können.

Abbildung einer allgemeinen Zellzählregel, bei der Sie Zellen zählen, die den oberen und rechten Rand des Hämozytometergitters berühren, aber die Zellen, die den unteren und linken Rand berühren, von der Zählung ausschließen.

Die ergebnisse sind da – berechnung von zellkonzentration und viabilität

Nachdem Sie Ihre Zellen gezählt haben, können Sie anhand der Zellzahl und des Verdünnungsfaktors die Gesamtzellzahl oder -konzentration in Ihrer ursprünglichen Probe mit der folgenden Formel bestimmen:

Jedes der neun Quadrate im verbesserten Neubauer-Gitter hat ein Volumen von 0,1 mm³. Der Multiplikationsfaktor von 10⁴ in der obigen Formel wandelt die Anzahl von Zellen pro 0,1 mm³ in Zellen pro ml um. Die meisten Hämozytometerquadrate haben ein Volumen von 0,1 mm³, so dass der Multiplikationsfaktor in den meisten Fällen 10⁴ beträgt. Die Tabelle auf der linken Seite zeigt die Multiplikationsfaktoren für andere Zählkammern.

Wenn Sie Zellen mit einer Zellfärbung zählen, können Sie auch die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmen. Die Verfolgung der Viabilität von Zellen kann die tägliche Pflege von Zellkulturen erleichtern und Ihnen helfen zu verstehen, wie Ihre Zellen auf unterschiedliche Umgebungen reagieren.³

Wenn Sie die Gesamtzahl der Zellen und die Anzahl der toten Zellen in Ihrer Probe kennen, können Sie die Viabilität der Zellen anhand der folgenden Formel berechnen:

Formel für die Viabilität von Zellen in Prozent

Fehler bei der zellzählung mit einem hämozytometer

Die Zellzählung mit einem Hämozytometer ist in der Regel fehleranfällig, wobei die Fehlerquote oft bei 20-30% liegt.2 Häufige Fehlerquellen reichen von menschlichem Versagen bei Verfahren und Berechnungen bis hin zu Fehlern, die durch ungleichmäßige Zellfärbung und Zelltrümmer verursacht werden.

Sie können Fehler minimieren, indem Sie sicherstellen, dass Sie so konsequent und präzise wie möglich arbeiten. Achten Sie darauf, Verdünnungen korrekt vorzubereiten, sorgfältig zu pipettieren, klare Zählrichtlinien festzulegen und sorgfältig darauf zu achten, was Sie als Zelle zählen. Denken Sie daran, Consistency is King! Die Durchführung zusätzlicher Zählungen kann ebenfalls sicherstellen, dass Ihre Ergebnisse zuverlässig sind, und kann Ihnen helfen, Fehler zu erkennen, bevor es zu spät ist. Normalerweise wiederholen wir alle Zellzählungen dreimal, aber „im Zweifelsfall führen Sie eine weitere Zählung durch!“

Wenn Sie mehr über die Fehlerreduzierung bei der manuellen Zellzählung erfahren möchten, bleiben Sie dran für unseren nächsten Blog-Beitrag „Die Präzision Ihrer manuellen Zellzählung aufdecken“.

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Weiterführende literatur

Blogbeitrag: Ist Trypanblau toxisch? Die dunkle Seite des beliebten Farbstoffs
Blogbeitrag : Alle Ihre Fragen zur Zellzählung, Beantwortet
Podcast: Standardisierung der Zellzählung
Mini Review: Warum die Arbeit mit Trypanblau nicht Empfehlenswert ist
Die NucleoCounter®-Reihe: Automatisierte Zellzähler und Analyseinstrumente

Verweis

Vembadi A, Menachery A, Qasaimeh MA.: Cell Cytometry: Review and Perspective on Biotechnological Advances. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:147.
Electron Microscopy Sciences: Neubauer Haemocytometry.
Stoddart MJ.: Cell viability assays: Introduction. Methods Mol Biol. 2011;740:1-6

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