Wie funktionieren automatische Zellzähler?

Warum automatische Zellzähler wichtig sind

Die pharmazeutische Industrie ist dafür bekannt einen bedachten Ansatz für neue Technologien zu wählen. Mit dem Aufkommen von Pharma 4.0 testen und implementieren Branchenführer jedoch viele neue automatisierte Lösungen.

Der Eckpfeiler dieses Paradigmenwechsels ist die Prozessanalysetechnologie (PAT).¹

PAT umfasst das Verständnis und die Kontrolle des Herstellungsprozesses in Echtzeit, um optimale Qualität sicherzustellen. Dieser Ansatz ermöglicht eine schnellere und effizientere Analyse von Herstellungsprozessen. Das Ergebnis von PAT ist die Unterstützung des „Qualität durch Design“ (QbD)-Ansatzes bei der Arzneimittelherstellung. QbD strebt einen „right first time“ Ansatz an, um die Qualität des fertigen Arzneimittels sicherzustellen. Die Vorteile dieses Ansatzes sind vielfältig, schnellere Zeitpläne und sicherere Medikamente wären hier als Beispiele anzuführen.

Ergebnisse automatisierter, PAT-basierter Ansätze zur biopharmazeutischen Produktion umfassen eine bessere:

• Arzneimittelqualität und -ausbeute
• Prozessverständnis und -kontrolle
• Reproduzierbarkeit

Derzeit befinden sich über dreitausend Zell- und Gentherapien in der Entwicklung.2 Für diese und andere zellbasierte Medikamente (z. B. Impfstoffe und Biologika) können Variationen in der Zellzahl und Viabilität während der verschiedenen Stufen des Herstellungsprozesses zu einer schlechten Produktqualität und -ausbeute führen. Auch Güter wie Bier und Wein erfordern präzise Hefekonzentrationen, um Geschmack und Qualität zu optimieren. Automatische Zellzähler helfen dabei, diese Eigenschaften auf eine zuverlässige Weise im Auge zu behalten. Darüber hinaus können sie einen Vorteil im Wettlauf um die schnellstmögliche Einführung von Produkten in Klinik oder Markt bieten. Die Verringerung von Ausfallzeiten und die Vermeidung von Engpässen sind wichtige Ziele von pharmazeutischen Unternehmen. Eine Verbesserung von Qualität und Prozessverständnis kommt auch den Patienten zugute, indem sie dazu beiträgt, sicherere Produkte zu schaffen.

Wie verbessern automatische Zellzähler die Präzision bei der Zellzählung? Dies wird in den nächsten Abschnitten erläutert. Prinzipiell sind die häufigsten Quellen für Variabilität: Variationen zwischen den Geräten, Variationen bei der Probenvorbereitung und Variationen zwischen den Benutzern. Lassen Sie uns nun erkunden, was automatische Zellzähler von halbautomatisierten und manuellen Methoden unterscheidet.

Was sind automatische Zellzähler?

Automatische Zellzähler sind analytische Instrumente, die die Anzahl der Zellen in einer Probe quantifizieren – und zwar mit minimalem menschlichem Eingriff. Neben der Zellzahl messen sie oft auch die Zellgröße und berechnen die Zellviabilität. Eine Gemeinsamkeit von automatischen Zellzählern ist es, menschliche Verzerrungen im Prozess zu reduzieren. Dies hat das Potenzial, die Reproduzierbarkeit der Forschung zu verbessern, die Produktion besser kontrollierbar zu machen und Produkte sicherer zu gestalten.

Automatische Zellzähler verwenden Software, um die Zellen zu analysieren. Die von ihnen bereitgestellten Daten können auch leicht zur weiteren Analyse exportiert werden. Einige automatische Zellzähler verfügen über zusätzliche Funktionen, die die Einhaltung von 21 CFR part 11 und den aktuellen guten Herstellungspraktiken (cGMP) gewährleisten. Trotz ihrer „automatisierten“ Natur erfordern viele automatische Zellzähler einige manuelle Schritte. Der Zweck eines automatischen Zellzählers sollte jedoch sein, so viele manuelle Schritte wie möglich zu eliminieren. Diese Überlegungen werden in den folgenden Abschnitten weiter diskutiert.

Arten von automatischen Zellzählern

Es gibt drei Kategorien von automatischen Zellzählern:

• Zellzähler basierend auf elektrischer Impedanz
• Durchflusszytometer
• Zellzähler basierend auf Bildzytometrie

Alle drei Typen sind heute im Einsatz und werden von verschiedenen Herstellern produziert. Einige Instrumente sind möglicherweise besser für den Einsatz in der Akademie geeignet, während andere für die cGMP-Herstellung von Arzneimitteln entwickelt wurden. Wieder andere können als Onlinemesswerkzeuge geeignet sein, während wieder andere für die Atline- oder Offline-Anwendung großartig sind. Der richtige Zellzähler für einen Prozess ist möglicherweise nicht der bevorzugte Zellzähler für einen anderen. Die Überlegungen, welcher Typ von automatischem Zellzähler am besten für Sie geeignet ist, hängen von den Gesamtkosten, der Leistung und der Bequemlichkeit ab.

Prinzipien der automatischen Zellzähler

Elektrische Impedanz

Zellzähler, die auf elektrischer Impedanz basieren, verwenden die Prinzipien des elektrischen Stroms, um Zellen zu zählen.

Die Idee dahinter ist, dass Partikel eine andere Leitfähigkeit aufweisen als eine sie umgebende Elektrolytlösung.

Diese Instrumente führen in einer Elektrolytlösung suspendierte Zellen durch eine enge Öffnung. Diese Öffnung ist von zwei Elektroden umgeben. Die Zellen passieren einzeln durch die Öffnung, und während sie dies tun, registrieren die Elektroden eine Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit (oder Impedanz). Jede Veränderung, wird gezählt und somit die Zellzahl bestimmt.

Diese Technologie wird seit den 1950er Jahren zur Entwicklung einer Vielzahl von Zellzählern und Analysegeräten verwendet.3 Ein großer Vorteil besteht darin, dass keine Färbung der Zellprobe erforderlich ist.

Es gibt jedoch einige häufige Fehlerquellen, die bei diesen Geräten inhärent sind. Die Hauptursache besteht darin, dass Partikel unspezifisch gezählt werden, sobald sie durch die Öffnung passieren. Manchmal können mehrere Partikel gleichzeitig passieren, was als Koinzidenzereignis bezeichnet wird.4 Ebenso können Partikel rückwärts durch die Öffnung fließen und doppelt gezählt werden.

Das Ändern der Größe der Öffnung oder die Verdünnung der Zellprobe sind typische Lösungsansätze für diese Probleme.

Elektrisch impedanzbasierte Instrumente sind nicht spezifisch für Zellen und werden manchmal als Partikelanalysatoren bezeichnet. Daher erfordern die Geräte eine kontaminationsfreie Suspension von Zellen, um genaue Zählungen zu liefern. Diese Instrumente eignen sich hervorragend zur Messung der Zellgröße, da die Größe der Zelle direkt proportional zur beobachteten elektrischen Impedanz ist.

Durchflusszytometer

Durchflusszytometer nutzen die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften von Zellen nach dem Prinzip der Lichtstreuung. Diese Geräte bestehen aus einem Fluidiksystem, einem optischen System und einem elektronischem Detektionssystem.

Suspendierte Zellen fließen einzeln in einem Flüssigkeitsstrom und treffen dann auf ein Laserlicht. Das Licht wird in Abhängigkeit von der intrazellulären Beschaffenheit der Zelle und den Eigenschaften der Zelloberfläche in verschiedene Richtungen gestreut.

Anschließend wird das Licht gesammelt, vom Computer in Daten umgewandelt und visualisiert.

Das Licht kann entweder nach vorne oder seitlich streuen. Vorwärts streuendes Licht wird verwendet, um Zellgröße und Viabilität zu bestimmen und zwischen Trümmern und lebenden Zellen zu unterscheiden. Seitlich streuendes Licht gibt uns Informationen über die internen Eigenschaften der Zelle.

Durchflusszytometrie ermöglicht sowohl die Zählung von Zellen als auch die Analyse von Organellen, Zelloberflächenmarkern und Nukleinsäure- oder Proteininhalt.

Die Durchflusszytometrie bildet die Grundlage für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), mit der Zellen anhand fluoreszierender Marker sortiert werden können.

Bei der Zellzählung sind Durchflusszytometer recht genau und können heterogene Zellproben und seltene Zellen mit hoher Geschwindigkeit analysieren.

Ein Nachteil von Durchflusszytometern besteht darin, dass sie eine tägliche Reinigung und regelmäßige Wartung ihrer Fluidik- und Optiksysteme erfordern. Auch wenn Reinigungsprotokollen korrekt befolgt werden, können Durchflusszytometer verstopfen, was dann spezielle Fähigkeiten erfordert und zu Betriebskosten führen kann.

Durchflusszytometer liefern wertvolle Daten, welche Wissenschaftlern helfen zu verstehen, wie Arzneimittel und Krankheiten die Zellgesundheit beeinflussen.

Bildbasierte Zellzähler

Bildbasierte Zellzähler oder Bildzytometrie basierte Zellzähler verwenden fortschrittliche Digitalkameras, Mikroskope und maschinelles Lernen, um Zellen zu zählen. Die Zellprobe wird auf einen Objektträger oder eine Kassette geladen und dann in den Bildzytometrie basierten Zellzähler eingesetzt. Der automatische Zellzähler macht dann ein oder mehrere Bilder von den Zellen, welche anschließend von einem Algorithmus analysiert werden. Nach der Bildverarbeitung liefert das Gerät die Zellzahl sowie die Viabilität und Zellgröße.

Damit Zellen unter dem Mikroskop sichtbar sind, müssen sie gefärbt werden. Einige verwenden Trypanblau, ähnlich wie Hämozytometer, während andere auf Fluoreszenzfarbstoffe angewiesen sind. Einige Bildzytometrie basierend Instrumente haben sowohl Hellfeld- als auch Fluoreszenzkanäle.

Trypanblau färbt abgestorbene Zellen, indem es ihre poröse Zellmembran durchdringt. Aufgrund der Färbung sehen lebende und abgestorbene Zellen unter dem Mikroskop unterschiedlich aus. Diese Färbemethode funktioniert gut bei vielen Zelltypen. Bei komplexen Zellproben entstehen jedoch Schwierigkeiten. Einige Zellproben aus Säugetieren können zum Beispiel rote Blutkörperchen enthalten, diese sehen unter dem Mikroskop anderen Säugetierzellen sehr ähnlich und können verwechselt und fälschlicherweise mitgezählt werden.

Die Fluoreszenzmikroskopie bietet in dieser Situation eine Lösung. Fluoreszierende Farbstoffe wie Acridinorange (AO) und 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) werden häufig zusammen verwendet, um lebende bzw. abgestorbene Zellen durch Färbung ihrer Zellkerne zu unterscheiden. Rote Blutkörperchen aus Säugetieren enthalten in der Regel keine Zellkerne und würden daher bei der Analyse durch einen AO und DAPI basierenden Zellzähler die Zellzahl nicht beinflussen.

Es gibt mehrere Vorteile von bildbasierten Zellzählern. Einer davon ist, dass sie im Allgemeinen keine umfangreichen Fluidiksysteme haben, was den Wartungsaufwand verringert. Darüber hinaus sind sie kompakt und bedürfen nur wenig Platz.

Der Algorithmus zur Zellzählung ist besonders wichtig bei der Bildzytometrie. Die meisten Bildzytometer sind mit mehreren Protokollen konfiguriert, von denen jedes geringfügige Anpassungen am Algorithmus enthält. Diese Flexibilität ermöglicht es dem Benutzer, den besten Ansatz für seine Zellprobe zu wählen.

Dies ist ein Vorteil von bildbasierten Zellzählern. Sie können zum Beispiel so programmiert werden, dass sie aggregierte Zellen zählen. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Zellen selbst in der Software des Instruments zu sehen sind (entweder auf einem PC oder auf dem Bildschirm des Zellzählers, sofern vorhanden).

Dies ist eine gute Vergewisserung, dass der Algorithmus auch funktioniert wie beabsichtigt. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist, dass zu viele Algorithmen den Prozess für den Benutzer verkomplizieren können.

Insgesamt haben bildbasierte Zähler einen geringen Platzbedarf und verbessern die Effizienz der Zellzählung.

Fazit

Automatisierte Zellzähler lösen die Herausforderungen, welche bei der manuellen Zählung von Zellen mit einem Hämozytometer entstehen. Sie tragen dazu bei, sicherere Medikamente herzustellen und zellbasierte Prozesse zu überwachen. Die Bedienung erfordert jedoch möglicherweise manuelles Probenhandling.

In der cGMP-Herstellung und im Bioprocessing spielen automatisierte Zellzähler eine wichtige Rolle bei der Überwachung der Zellviabilität, des Zellwachstums und der Zellkonzentration. Deswegen sind sie ideal für Prozesse wie der Herstellung von Zell- und Gentherapien. Zahlreiche Anwendungen und Branchen profitieren von zuverlässigen, automatisierten Zellzählern, und der Bedarf nach ihnen wird voraussichtlich wachsen.

Bei der Auswahl eines automatisierten Zellzählers sollten Sie dessen Benutzerfreundlichkeit und Leistungsfähigkeit berücksichtigen. Testen Sie ihn an einer Reihe von Zellproben und informieren Sie sich, z. B. durch das Lesen von Beiträgen wie diesem und den Austausch mit Ihren Kollegen.

Viel Erfolg beim Zellzählen!

Weiterführende Literatur

• Mini-review: Manuell versus Automatisierte Zellzählung
• Journal: Der ultimative Leitfaden für Zellzähler
• Journal: Wie man Zellen mit einem Hämozytometer zählt
• Die NucleoCounter®-Reihe: Automatisierte Zellzähler-Instrumente und -Analysatoren

Verweise

1. Office of Pharmaceutical Science in the Center for Drug Evaluation and Research (CDER). PAT — A Framework for Innovative Pharmaceutical Development, Manufacturing, and Quality Assurance. Available at: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/pat-framework-innovative-pharmaceutical-development-manufacturing-and-quality-assurance
2. Lohr, A. (2023). 2023’s market outlook for cell and gene therapies. Available at: https://www.cellandgene.com/doc/s-market-outlook-for-cell-and-gene-therapies-0001
3. Simson, E. (2013). Wallace Coulter’s life and his impact on the world. International Journal of Laboratory Hematology – Wiley Online Library. Available at: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/ijlh.12069
4. Wynn, E. J. W., & Hounslow, M. J. (1997). Coincidence correction for electrical-zone (Coulter-counter) particle size analysers. Powder Technology, 93(2), 163–175. https://doi.org/10.1016/S0032-5910(97)03267-1