Warum konsistente zellzählung der schlüssel zum verständnis der frühen embryonalentwicklung ist

Dr. Naomi Moris und ihr Team vom Francis Crick Institute verwenden embryonale Stammzellsysteme, um die frühen Stadien der menschlichen Embryonalentwicklung zu modellieren. Ihre Prozesse beruhen auf einer hochgenauen und wiederholbaren Zellzählung. Aus diesem Grund haben sie kürzlich in einen NucleoCounter® NC-202™ investiert. In diesem Beitrag sprachen wir mit Dr. Peter Baillie-Benson, Senior Laboratory Research Scientist bei der Moris-Gruppe, um mehr über ihre Arbeit zu erfahren und warum die Zellzählung für sie so wichtig ist.

Das Studium sich entwickelnder Embryonen kann uns helfen, die Mechanismen hinter der menschlichen Entwicklung zu verstehen und was passiert, wenn diese Mechanismen schief gehen. Die Untersuchung menschlicher Embryonen ist jedoch mit ethischen Überlegungen und regulatorischen Einschränkungen verbunden, die die Verwendung menschlicher Embryonen für die Forschung einschränken.

Das Moris-Labor interessiert sich für den Prozess der Gastrulation. Die Gastrulation ist ein Schritt in der frühen Embryonalentwicklung, bei dem sich der Embryo von einer einzelnen Schicht Epithelzellen in eine mehrschichtige, mehrdimensionale Struktur umwandelt. Die Gastrulation bildet drei embryonale Keimblätter, das Entoderm, Ektoderm und Mesoderm, die sich später zu verschiedenen Körperteilen entwickeln. Kurz gesagt, die Gastrulation ist der erste Schritt zur Bildung eines Körperplans.

Untersuchung der gastrulation mit stammzellsystemen

Magenschleimhaut durch ein Mikroskop betrachtet

„Die britischen Vorschriften erlauben es Ihnen nur, menschliche Embryonen bis zu 14 Tagen oder dem Auftreten des Primitivstreifens zu untersuchen, je nachdem, was früher eintritt. Wir können also nichts über die sehr frühen Stadien der Gastrulation hinaus mit Embryonen untersuchen“, erklärt Peter. Stattdessen verwenden er und das Team menschliche Gastruloide, dreidimensionale Strukturen embryonaler Stammzellen, um die Gastrulation zu modellieren.

„Unsere Arbeit konzentriert sich auf einen Schlüssel-Assay, bei dem wir menschliche Stammzellen unter sich selbst erneuernden Bedingungen züchten. Dann aggregieren wir sie in genau definierten Zahlen, um sehr kleine Zellhaufen wie ein 3D-Sphäroid zu bilden.

Im Laufe der Zeit beginnen diese Aggregate, ihre Genexpression zu polarisieren und die Rudimente eines Körperplans zu entwickeln. Sie erhalten eine Kopf-Schwanz-Polarität und beginnen, sich in diese Richtung zu strecken und einige der Gene zu exprimieren, die man bei einem sich entwickelnden menschlichen Embryo erwarten würde“, sagt er.

„Wir studieren sie ungefähr 3 Tage lang, also eine ziemlich kurze Zeitspanne. Aber in dieser Zeit können wir ziemlich viel über ihre Genexpression lernen.“

Peter und das Team hoffen, dass die Befragung menschlicher Gastruloide ihnen ein besseres Verständnis der menschlichen Entwicklungsprinzipien und Entwicklungskrankheiten wie angeborener Fehlbildungen vermitteln wird. „Wir können Gastruloide auch verwenden, um nach potenzieller Arzneimittelteratogenität zu suchen, also zu prüfen, ob eine bestimmte Verbindung die Entwicklung auf eine Weise dysregulieren könnte, die den Embryo schädigen könnte, was uns helfen könnte, die Arzneimittelsicherheit zu verstehen und gleichzeitig den Einsatz von Tiermodellen in der Forschung zu reduzieren „ fügt er hinzu.

Warum ist eine konsequente zellzählung so wichtig?

„Der Grund, warum die Zellzählung für uns so wichtig war, liegt darin, dass unser menschlicher Gastruloid-Assay nur funktioniert, wenn Sie zunächst eine ganz bestimmte Anzahl von Zellen im Aggregat kultivieren“, erklärt Peter. „Sie müssen eine bestimmte Dichte haben, um einen Zustand zu erreichen, in dem sie sich selbst zu Aggregaten organisieren können.“

„Bei Stammzellsystemen gibt es oft eine ziemlich große Variabilität, insbesondere zwischen Linien, Experimenten und Benutzern, also versuchen wir immer, diese Variabilität auszugleichen und konsistentere Ergebnisse zu erzielen. Wenn dieses Assay funktioniert, funktioniert er sehr gut, aber er hängt davon ab, dass alles so konsistent wie möglich ist“, erklärt er.

„In unserem Protokoll beginnen wir damit, die Zellen in einer bestimmten Dichte zu plattieren, und lassen sie dann etwa 5 Tage lang liegen, bevor wir die Aggregate herstellen. Aber wenn Sie die Zellen mit einer bestimmten Dichte ausplattieren und sie dann erweitern, wird jeder Fehler in dieser ersten Messung vergrößert“, erklärt Peter. „Konsistenz bei unserer Zellzählung ist wirklich wichtig. Wir wollen wissen, wenn wir 40.000 Zellen ausplattieren, dass wir wirklich diese Zahl in der Schale haben und dass es keine großen Schwankungen geben wird”.

Von der manuellen zur automatisierten zellzählung

„Am Anfang haben wir alle Zählungen manuell mit Hämozytometern durchgeführt, was den Durchsatz begrenzt, weil es darauf angewiesen ist, dass dafür geschultes Personal schnell und genau arbeitet“, sagt Peter. Der erste automatisierte Zellzähler, den sie ausprobierten, stützte sich auf Einweg-Objektträger und bereitete Suspensionen mit Acridinorange und Propidiumiodid vor, um die lebenden und toten Zellen zu zählen. Dieses System war inkonsistent, und Peter vermutet, dass ein Großteil der Variation darauf zurückzuführen ist, wie verschiedene Benutzer ihre Suspensionen zubereitet und die Einstellung des Zellzählers angepasst haben.

Peter wusste, dass er ein konsistenteres Instrument brauchte, aber auch einen Zähler, der über einen großen Dynamikbereich hinweg arbeiten konnte. „Mit wie vielen Zellen wir arbeiten, ist sehr unterschiedlich. Wir plattieren Zehntausende von Zellen in Wells, aber wenn wir die Zellen präparieren, können wir mit einer Million oder sogar zehn Millionen Zellen arbeiten. Wir versuchen also, an zwei Größenordnungen zu arbeiten: von Zehntausenden bis zu Millionen. Da musste unser Zellenzähler mithalten.“

Aggregierte Stammzellen, betrachtet durch ein Mikroskop

„Eine weitere wichtige Sache für uns war, dass der Zähler Zellen innerhalb von Klumpen oder Clustern zählen konnte. Dies ist wichtig, denn wenn Sie neue Benutzer im Labor haben, sind diese möglicherweise nicht so effektiv bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen, die sehr einfach zu zählen sind. Sie benötigen also einen Zähler, der berechnet, wie viele Zellen tatsächlich vorhanden sind sind, bevor Sie sie plattieren“, sagt er.

Testen des NC-202™

„Wir haben eine ziemlich lange Demo mit dem NC-202™ gemacht und wir haben es wirklich ausgiebig getestet“, erklärt Peter.

„Ich habe viele Zellsuspensionen mit unterschiedlichen Verdünnungen und Dichten hergestellt und sie durch alle drei Zähler gegeben. Ich habe mir die Variabilität wiederholter Zählungen derselben Aufhängung angesehen, um den konsistentesten Zähler zu finden“, sagt er.

Der NucleoCounter® NC-202™ wurde entwickelt, um die Unterschiede zwischen den Benutzern zu beseitigen. Er verwendet unsere individuell volumenkalibrierte Via2-Cassette™, die immobilisierte, vorportionierte Farbstoffe enthält, um Abweichungen von der Probenvorbereitung zu eliminieren. Der NC-202™ verwendet außerdem einen festen Fokus und standardisierte Protokolle, sodass es keine Abweichungen davon gibt, wie Bediener den Zähler verwenden.

„Ich habe auch überprüft, ob die Zählungen über einen Bereich von etwa 1 zu 1000 bis zu einer unverdünnten Suspension gut waren, nur um sicherzustellen, dass es einen guten dynamischen Bereich der Zählung gibt.“ Der NC-202™ lieferte auch den großen dynamischen Bereich, den Peter und das Team benötigten, und lieferte eine zuverlässige Zellzählung von 5 × 10 4 bis 1 × 10 7 Zellen/ml. Es verfügt auch über unseren leistungsstarken Declustering-Algorithmus zum genauen Zählen aggregierter Zellen.

Jetzt, da Peter einen Zellzähler gefunden hat, der ihren Anforderungen entspricht, können er und das Team sich auf die wichtige Arbeit des Verständnisses der Gastrulation konzentrieren.

Um mehr über die Forschung des Moris-Labors zu erfahren, können Sie deren Website besuchen oder eine aktuelle Veröffentlichung der Gruppe lesen.

Weiterführende literatur

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