Es gibt alternative, genauere methoden

Die Hellfeldmikroskopie wird zur Validierung und Quantifizierung von Zellkulturen eingesetzt. Es gibt mehrdeutige Färbemuster und verlässt sich auf eine Reihe von Parametern, einschließlich Rundheit und Gleichmäßigkeit, um Zellen von nicht-zellulären Partikeln zu unterscheiden.

Trypanblau färbt abgestorbene Zellen in Schattierungen von hellblau bis schwarz, abhängig von der Gesamtviabilität der Zellkultur. Bei Verwendung eines Hellfeldmikroskops können Zellen, die sehr leicht mit Trypanblau angefärbt sind, nur schwer von ungefärbten Zellen unterschieden und somit schwer identifiziert werden.

Zudem werden die einzelnen Labormitglieder jeweils eine etwas subjektive Ansicht darüber haben, was eine tote und was eine lebende Zelle ist. Daher birgt die Verwendung von Trypanblau zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen das Risiko von Abweichungen zwischen Benutzern und Geräten.

Aus diesen Gründen werden fluorometrische Assays als bessere Wahl für die Bewertung der Viabilität angesehen als kolorimetrische Assays, wie z. B. Trypanblau⁴.

Da Zellen eine relativ konstante Menge an DNA/RNA haben, erzeugen die DNA-interagierenden Fluorophore Acridinorange (AO) und 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) ein einheitliches Färbemuster für die Quantifizierung von Zellen, verglichen mit dem unspezifischen Färbemuster bei der hellfeldbasierten Analyse.

AO ist membranpermeabel und färbt die gesamte Zellpopulation, während DAPI nur die tote Zellpopulation färbt. Daher bietet die fluorometrische Bestimmung der Viabilität unter Verwendung von AO und DAPI eine überragende Genauigkeit bei der Identifizierung lebender und toter Zellen mit reduziertem Rauschen und Schwankungen.

Unter verschluss in EU-laboren

Die ECHA hat kürzlich Änderungen vorgenommen, um die Tatsache hervorzuheben, dass Trypanblau für den Menschen giftig ist, und um seine Verwendung einzuschränken.

Durch die Einstufung als krebserregend sollen die Anwender motiviert werden, die Verwendung von Trypanblau in Laboren in ganz Europa auslaufen zu lassen⁵.

Diese Einstufung hat bereits dazu geführt, dass Länder wie Dänemark ab März 2021 eine Genehmigung für die Verwendung von Trypanblau von den Laboren verlangen. Die Genehmigung kann nur erteilt werden, wenn die Verwendung in ihrem Arbeitsablauf unbedingt erforderlich ist^{6, 7}.

Darüber hinaus sind die Genehmigungsinhaber verpflichtet, die Exposition von Labormitarbeitern gegenüber Trypanblau zu begrenzen, indem sie eine sichere Arbeitsumgebung durch die Erstellung von Standardarbeitsanweisungen (SOPs) für alle Arbeitsabläufe, bei denen Trypanblau verwendet wird, gewährleisten.

Dazu gehört auch, dass alle mit Trypanblau belasteten Proben und Einwegartikel getrennt vom normalen Laborabfall erfasst und entsorgt werden.

Auch wenn dies derzeit nicht für Länder außerhalb Europas gilt, ist sich die wissenschaftliche Gemeinschaft im Allgemeinen einig, dass mit Trypanblau Risiken verbunden sind5, was bedeutet, dass seine Verwendung eingeschränkt werden sollte, da es den Anwendern ernsthaften Schaden zufügen kann.

Alternativen zu trypanblau

Alternativen zu Trypanblau sind AO und DAPI, die nicht krebserregend sind8, 9. Als Alternative zu Trypanblau können sie eine sicherere Arbeitsumgebung unterstützen.

Da die Via2-Cassette™ diese Farbstoffe einkapselt, garantiert ihr Design, dass jeglicher Kontakt des Anwenders mit ihnen ausgeschlossen ist. Diese Kassettentechnologie lässt sich ohne weiteres als Sicherheitsmaßnahme in Laboratorien auf der ganzen Welt etablieren.

Die Via2-Cassette™ ist ein einzigartiges Mikrofluidikgerät, das eine unvergleichliche Genauigkeit und Präzision der Zellzählung bietet und die Belastung des Anwenders durch Chemikalien eliminiert. Die Via2-Cassette™ enthält eine eingebaute Pipette, die Fehler beim Pipettieren und Färben verhindert.

Die Fluoreszenzfarbstoffe AO und DAPI sind in den Kanälen der Kassette immobilisiert und färben automatisch die gesamte bzw. tote Zellpopulation.

Während des gesamten Zellzählvorgangs bleiben AO und DAPI im Inneren des mikrofluidischen Geräts, wodurch das Risiko einer Exposition deutlich reduziert wird. Die Via2-Cassette™ wird nach jedem Gebrauch entsorgt und trägt so zur Gewährleistung einer sicheren Arbeitsumgebung bei.

Die Via2-Cassette™ wird mit dem NucleoCounter® NC-202™ verwendet, einem automatisierten fluoreszierenden Zellzähler, der eine Analyse der Gesamt- und Lebendzellen, der Totzellkonzentration, der Viabilität und des DebrisIndex™ einer Probe in etwa 30 Sekunden ermöglicht.

Die Geräte werden unter Verwendung hochwertiger, langzeitstabiler Komponenten gebaut, was zusammen mit umfangreichen Kalibrierverfahren, die zum Zeitpunkt der Herstellung durchgeführt werden, zu geringen Abweichungen zwischen Geräten, Benutzern und Standorten führt. Diese Technologie stellt ein optimales Maß an Präzision für Ihre Zellzählung bereit.

Der NucleoCounter® NC-202™ mit der Via2-Cassette™, kombiniert branchenführende Genauigkeit und Präzision, die konsistente Ergebnisse bereitstellt und gleichzeitig den Anwender vor Schaden bewahrt.

Verweise

1. JR Tennant: Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation, 1964. 2: p. 685-94.
2. KT Tsaousis, N Kopsachilis, IT Tsinopoulos et al.: Time-dependent morphological alterations and viability of cultured human trabecular cells after exposure to Trypan blue. Clin Exp Ophthalmol, 2013. 41(5):484-90.
3. AKH Kwok, C-K Yeung, TYY Lai, K-P Chan, CP Pang: Effects of trypan blue on cell viability and gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Br J Ophthalmol. 2004;88(12):1590-4.
4. SA Altman, L Randers, G Rao: Comparison of trypan blue dye exclusion and fluorometric assays for mammalian cell viability determinations. Biotechnol Prog. 1993;9(6):671-4.
5. European Chemical Agency (ECHA): Substance Infocard: Tetrasodium 3,3′-[(3,3′-dimethyl[1,1′-biphenyl]-4,4′-diyl)bis(azo)]bis[5-amino-4-hydroxynaphthalene-2,7-disulphonate]
6. Arbejdstilsynet: AT-vejledninger: Kræftrisikable stoffer og materialer
7. Retsinformation: Kræftbekendtgørelsen: Bekendtgørelse om foranstaltninger til forebyggelse af kræftrisikoen ved arbejde med stoffer og materialer
8. European Chemical Agency (ECHA): Substance Infocard: N,N,N’,N’-tetramethylacridin-3,6-yldiamine hydrochloride
9. European Chemical Agency (ECHA): Substance Infocard: 2-phenylindole-4′,6-dicarboxamidine dihydrohydrochloride (hydrate)