Warum die Verwendung von Trypanblau keine gute Idee ist

Eine Übersicht zur Genauigkeit von Zellzahl- und Viabilitätsbestimmung mittels Trypanblau

Die Toxizität von Trypanblau beeinträchtigt die Messgenauigkeit somit gleich auf zweierlei Weise: (i) Die Viabilität verändert sich über die Zeit, und (ii) die Viabilität der Gesamtzellpopulation wird unterbewertet².

Es gibt deutlich genauere Alternativen

Die Hellfeldmikroskopie wird häufig zur Validierung und Quantifizierung von Zellkulturen verwendet. Diese liefert jedoch unterschiedlichste Färbemuster und stützt sich auf eine Reihe von Parametern, wie die Rundheit und Gleichmäßigkeit, um Zellen von nichtzellulären Partikeln zu unterscheiden. Zudem färbt Trypanblau hierbei die toten Zellen, abhängig von der Gesamtviabilität der Zellkultur, in Abstufungen von hellblau bis hin zu schwarz. Mittels Hellfeldmikroskopie können Zellen, die nur sehr leicht mit Trypanblau angefärbt sind, somit nur schwer von nicht gefärbten Zellen unterschieden werden. Hinzu kommt, dass Labormitarbeiter in der Regel zu einer subjektiven Interpretation neigen, welche Zellen als tot oder lebendig gelten. Somit birgt die Verwendung von Trypanblau für die lebend/tot Unterscheidung die Gefahr von Messschwankungen zwischen einzelnen Mitarbeitern und verwendeten Instrumenten.

Zur Bewertung der Zellviabilität gelten daher fluorometrische Assays als die bessere Wahl gegenüber kolorimetrischen Methoden, wie Trypanblau⁴. Da Zellen einen relativ konstanten DNA/RNA-Anteil besitzen, erzeugen die DNA-interagierenden Fluophore Acridinorange (AO) und 4‘,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), im Vergleich zur unspezifischen Färbung bei der Hellfeldmikroskopie, ein einheitliches Färbemuster, welches für eine solide Quantifizierung der Zellen verwendet werden kann. AO ist zudem membrandurchlässig und färbt somit die gesamte Zellpopulation an, während das membranundurchlässige DAPI nur in tote Zellen eindringen und diese anfärben kann. Auf Grund dieser Spezifität und dem hohen Signal-Rauschverhältnis der verwendeten Farbstoffe, bietet die fluorometrische Bestimmung der Zellviabilität mittels AO und DAPI eine unübertroffene Genauigkeit bei der Detektion und Unterscheidung von lebenden und toten Zellen.

Auf die Sicherheit kommt es an!

Die Gewährleistung eines sicheren Arbeitsumfeldes ist für Unternehmen von entscheidender Bedeutung. Nach Angaben der Europäischen Chemischen Agentur (ECHA), steht Trypanblau im Verdacht Krebs und Gendefekte zu hervorzurufen, sowie der Fruchtbarkeit und dem ungeborenen Kind zu schaden⁵. Infolgedessen sollten besondere Vorkehrungen getroffen werden, um Mitarbeiter beim Umgang mit Trypanblau zu schützen und um den Farbstoff anschließend sicher zu entsorgen.

Ein weiterer wichtiger Aspekt beim Umgang mit Trypanblau ist, dass es als Karzinogen der Gruppe 2B (ECHA⁵) eingestuft wird. Dies macht die Arbeit mit Trypanblau für die Labormitarbeiter potenziell gefährlich, da eine Exposition nach Möglichkeit vermieden werden sollte.

Es gibt sichere Alternativen für die Zellzahlbestimmung, welche zudem höhere Präzision und bessere Genauigkeit bieten.

Die Via2-Kassette™ ist ein einzigartiges Mikrofluidiksystem, welches eine beispiellose Genauigkeit und Präzision der Zellzahlbestimmung bietet und die Exposition des Benutzers gegenüber Chemikalien verhindert. Die Via2-Kassette™ verfügt über eine eingebaute Pipette, wodurch Fehler beim Pipettieren und Färben verhindert werden. Die Fluoreszenzfarbstoffe AO und DAPI sind bereits in den Kanälen der Kassette immobilisiert und färben automatisch die Gesamtzellpopulation (AO) bzw. die Totzellpopulation (DAPI). Während des gesamten Messvorgangs verbleiben AO und DAPI im Mikrofluidiksystem, wodurch das Expositionsrisiko erheblich verringert wird. Nach der Messung wird die Via2-Kassette™ einfach entsorgt, um ein sicheres Arbeitsumfeld zu gewährleisten.

Die Via2-Kassette™ wird zusammen mit dem NucleoCounter® NC-202™ verwendet. Dieser ist ein automatisiertes und fluoreszenz-basiertes Zellzählgerät, welches die Gesamtzellzahl, die Zellviabilität sowie den DebrisIndex™ einer Probe in ungefähr 30 Sekunden bestimmt. Die Instrumente bestehen aus hochwertigen Komponenten, die über die Zeit stabil bleiben. Zusammen mit umfangreichen, werksseitigen Kalibrierungsverfahren, ergeben sich hierdurch sehr geringe Abweichungen zwischen den einzelnen Instrumenten, Benutzern und Laborstandorten. Diese Technologie bietet somit ein optimales Maß an Präzision für Ihre Zellzählung.

Der NucleoCounter^® NC-202™, in Verbindung mit unseren Via2-Kassetten™, kombiniert branchenführende Genauigkeit und Präzision, welche konsistente Ergebnisse liefert und gleichzeitig die Benutzer vor potentiell gefährlichen Chemikalien schützt.

Referenzen:

1. JR Tennant: Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation, 1964. 2: p. 685-94.
2. KT Tsaousis, N Kopsachilis, IT Tsinopoulos, SA Dimitrakos, FE Kruse, U Welge-Luessen: Time-dependent morphological alterations and viability of cultured human trabecular cells after exposure to Trypan blue. Clin Exp Ophthalmol, 2013. 41(5):484-90.
3. AKH Kwok, C-K Yeung, TYY Lai, K-P Chan, CP Pang: Effects of trypan blue on cell viability and gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Br J Ophthalmol. 2004;88(12):1590-4.
4. SA Altman, L Randers, G Rao: Comparison of trypan blue dye exclusion and fluorometric assays for mammalian cell viability determinations. Biotechnol Prog. 1993;9(6):671-4.
5. European Chemical Agency (ECHA): Substance Infocard: Tetrasodium 3,3′-[(3,3′-dimethyl[1,1′-biphenyl]-4,4′-diyl)bis(azo)]bis[5-amino-4-hydroxynaphthalene-2,7-disulphonate]