Manuelle vs. automatisierte Zellzählung
wie automatisierte Zellzählgeräte die 4 Hauptprobleme der manuellen Zellzählung lösen können
In vielen Laboren werden Zellkulturen immer noch standardisiert durch Trypanblau-Färbung in einem Hämozytometer gezählt. Dieser Artikel beschäftigt sich mit den Herausforderungen der manuellen Zellzählung und veranschaulicht, wie diese Probleme durch die automatisierte Zellzählung vermieden werden können. Für die Geräte der NucleoCounter® Familie wurden weiterhin verschiedene Assays entwickelt, die eine Zellzählung selbst für adhärente und aggregierte Zellen erlauben sowie einen immensen Fortschritt bei der präzisen und reproduzierbaren Zellzählung von Säugetierzellen darstellen.
Herausforderungen bei der manuellen Zellzählung von Säugetierzellen
Die Kultur von Säugetierzellen erweist sich oftmals als schwierig, da die Zellen empfindlich gegenüber jeglichen Veränderungen sind und ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit während der Kultivierung benötigen. Somit ist es sehr wichtig, die genaue Zellkonzentration und Viabilität der Zellprobe für die Weiterkultivierung, Wachstumsrate oder für das Einfrieren der Zellen zu bestimmen1,2. Jedoch ist die manuelle Zellzählung äußerst zeit- und arbeitsaufwändig sowie fehlerbehaftet und hat stark variable Ergebnisse zur Folge.
Die häufigsten Probleme bei der manuellen Zellzählung sind:
- Die subjektive Definition einer Zelle
- Verdünnung, Volumen und Pipettierfehler
- Verwendung der Trypanblau-Färbung für die Bestimmung der Viabilität
- Zählen von ausreichend vielen Events
1. Die subjektive Definition einer Zelle
2. Verdünnung, Volumen und Pipettierfehler bei der manuellen Zellzählung
3. Bestimmung der Viabilität: Trypanblau oder DAPI?
4. Zählen von ausreichend vielen Events
Vermeiden Sie anwenderspezifische Fehler durch die Verwendung der Via1-Cassette™
Die Via1- Cassette™ (Abbildung 3) eliminiert jegliche Subjektivität während der Messung:
- Keine Subjektivität – Die Software erkennt automatisch bei jeder Messung eine Zelle aufgrund des Acridinorange-Signals.
- Keine anwenderspezifischen Fehler beeinflussen das Ergebnis – Die Via1-Cassette™ besitzt ein vorkalibriertes Volumen der Messkammer und gewährleistet präzise und reproduzierbare Ergebnisse.
- Die Via1-Cassette™ enthält bereits die beiden immobilisierten Fluorophore Acridinorange und DAPI für die Bestimmung der Gesamtzellzahl und der Anzahl an toten Zellen.
- Befindet sich die Zellzahl außerhalb des optimalen Bereiches, wird dies in der Software des NucleoCounters® angezeigt.
Die Via1-Cassetten™ sind für den einmaligen Gebrauch bestimmt und können sehr einfach mit der Zellsuspension beladen werden. Hierfür wird die Via1-Cassette™ in die Zellsuspension eingeführt und der Kolben betätigt, wodurch die Zellsuspension automatisch von der Via1-Cassette™ aufgenommen wird.
Abbildung 3: Die Via1-Cassette™ wurde entwickelt, um eine schnelle und effiziente Analyse der Viabilität und der Zellkonzentration in nur einem Schritt zu gewährleisten. Die beiden Fluorophore Acridinorange und DAPI färben alle Zellen bzw. nur die toten Zellen an.
Automatisierte Zellzählgeräte für eine höhere Präzision und Reproduzierbarkeit
Abbildung 4. Bildgebende Zytometrie der NucleoCounter® Geräte. Das Licht der LEDs wird durch Anregungsfilter gefiltert und durch die Messkammer der Via1-Cassette™ geleitet. Das abgestrahlte Licht wird durch einen Emissionsfilter geleitet und das Signal von einer Kamera detektiert.
Die Fluorophore für die Zellzählung
Literatur
- Phelan, M.C., Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol, 2007. Chapter 1: p. Unit 1.1.
- Freshney, R.I., Basic Principles of Cell Culture. 2006: p. 1–22.
- Nielson, L., G. Smyth, and P. Greenfield, Hemacytometer Cell Count Distributions: Implications of Non-Poisson Behavior. Biotechnology Progress, 1991. 7(6): p. 560-563.
- Shah, D., et al., NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes. Cytotechnology, 2006. 51(1): p. 39-44.
- Tennant, J.R., Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation, 1964. 2: p. 685-94. PMID: 14224649.
- Robbins, E. and P.I. Marcus, Dynamics of Acridine Orange-Cell Interaction. I. Interrelationships of acridine orange particles and cytoplasmic reddening. J Cell Biol, 1963. 18: p. 237-50. PMID: 14079487.
- Kubista, M., B. Akerman, and B. Nordén, Characterization of interaction between DNA and 4′,6-diamidino-2-phenylindole by optical spectroscopy. Biochemistry, 1987. 26(14): p. 4545-53. PMID: 3663606.
Author:
Merethe Mørch Frøsig, PhD, MSc
Field Application Scientist, ChemoMetec A/S
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