Die Kultur von Säugetierzellen erweist sich oftmals als schwierig, da die Zellen empfindlich gegenüber jeglichen Veränderungen sind und ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit während der Kultivierung benötigen. Somit ist es sehr wichtig, die genaue Zellkonzentration und Viabilität der Zellprobe für die Weiterkultivierung, Wachstumsrate oder für das Einfrieren der Zellen zu bestimmen^1,2. Jedoch ist die manuelle Zellzählung äußerst zeit- und arbeitsaufwändig sowie fehlerbehaftet und hat stark variable Ergebnisse zur Folge.

Die häufigsten Probleme bei der manuellen Zellzählung sind:

1. Die subjektive Definition einer Zelle
2. Verdünnung, Volumen und Pipettierfehler
3. Verwendung der Trypanblau-Färbung für die Bestimmung der Viabilität
4. Zählen von ausreichend vielen Events

Viele Fehler passieren schon beim Vorbereiten und Laden der Zellprobe in die Zählkammer. Da die Zählkammer ein genau definiertes Volumen besitzt, kann sich der Abstand zwischen der Zählkammer und dem Deckglas geringfügig vergrößern wenn zu viel Zellsuspension in die Zählkammer pipettiert wird (Abbildung 2). Basierend auf dem Volumen wird dadurch eine nicht-korrekte Zellzahl berechnet. Andere häufige Fehlerquellen stellen Pipettier- oder Verdünnungsfehler währen einer seriellen Verdünnung dar.

Abbildung 2. Seitenansicht eines Hämozytometers ohne Zellprobe (links) und mit Zellprobe (rechts). Durch das Laden des Hämozytometers mit der Zellsuspension vergrößert sich das Volumen der Zählkammer. Dies führt zu einer ungenauen Bestimmung der Zellzahl: Das Probenvolumen wird unter-, die Zellkonzentration überschätzt.

Für die manuelle Bestimmung der Viabilität in einem Hämozytometer wird häufig die Trypanblau-Färbung verwendet. Hierbei färbt Trypanblau tote Zellen mit einer permeablen Zellmembran an, lebende Zellen werden nicht angefärbt. Jedoch ist Trypanblau toxisch für Zellen und kann auch viable Zellen schon nach 5-30 Minuten Inkubationszeit anfärben. Als Nebeneffekt kann bei einer Trypanblau-Färbung oftmals eine sehr niedrige Viabilität der Zellsuspension festgestellt werden⁵. Ein selektiver nicht-Zellpermeabler Farbstoff wie z.B. DAPI wäre somit besser dafür geeignet, eine präzise Aussage über die Viabilität zu treffen.

Für die Bestimmung der Zellzahl mit der Neubauer Zählkammer sind insgesamt 10 separate Zählbereiche mit einem Gesamtvolumen von 1 µl für jede Zellprobe gedacht¹. Ungeachtet der Zellkonzentration wird jedoch meist ein viel kleineres Volumen (ca. 0,4 µl) mit deutlich weniger Zellen (ca. 100 Zellen) ausgezählt. Ein solch geringes Volumen für die Zellzählung erhöht die Varianz jedoch entscheidend: Aufgrund der rein statistischen Berechnung beträgt die Varianz bereits 10 % bei einer Gesamtzählung von 100 Zellen. Und dies alles ohne weitere Variablen einzubeziehen.

Die Via1- Cassette™ (Abbildung 3) eliminiert jegliche Subjektivität während der Messung:

• Keine Subjektivität – Die Software erkennt automatisch bei jeder Messung eine Zelle aufgrund des Acridinorange-Signals.
• Keine anwenderspezifischen Fehler beeinflussen das Ergebnis – Die Via1-Cassette™ besitzt ein vorkalibriertes Volumen der Messkammer und gewährleistet präzise und reproduzierbare Ergebnisse.
• Die Via1-Cassette™ enthält bereits die beiden immobilisierten Fluorophore Acridinorange und DAPI für die Bestimmung der Gesamtzellzahl und der Anzahl an toten Zellen.
• Befindet sich die Zellzahl außerhalb des optimalen Bereiches, wird dies in der Software des NucleoCounters^® angezeigt.

Die Via1-Cassetten™ sind für den einmaligen Gebrauch bestimmt und können sehr einfach mit der Zellsuspension beladen werden. Hierfür wird die Via1-Cassette™ in die Zellsuspension eingeführt und der Kolben betätigt, wodurch die Zellsuspension automatisch von der Via1-Cassette™ aufgenommen wird.

Abbildung 3: Die Via1-Cassette™ wurde entwickelt, um eine schnelle und effiziente Analyse der Viabilität und der Zellkonzentration in nur einem Schritt zu gewährleisten. Die beiden Fluorophore Acridinorange und DAPI färben alle Zellen bzw. nur die toten Zellen an.

Die NucleoCounter^® Geräte der Firma Chemometec A/S gehören zu den präzisesten und nutzerfreundlichsten Systemen auf dem Markt⁴. Hierbei handelt es sich um bildgebende Zytometer basierend auf einem Fluoreszenzmikroskop, welches Fluorophore für die Detektion von verschiedenen Zellpopulationen verwendet (Abbildung 4). Als Lichtquellen dienen LEDs, diese haben eine lange Lebensdauer und weisen eine hohe Stabilität auf. Passende Anregungsfilter lassen nur Licht einer bestimmten Wellenlänge passieren, sodass eine optimal Anregung der Fluorophore in der Via1-Cassette™ gewährleistet wird. Das abgestrahlte Licht wird durch Emissionsfilter gefiltert und auf eine digitale Kamera fokussiert. Die bildgebende Zytometrie mit den NucleoCounter^® Geräten generiert qualitativ hochwertige Daten und erlaubt eine visuelle Inspektion der Daten durch die begleitende Software.

Abbildung 4. Bildgebende Zytometrie der NucleoCounter^® Geräte. Das Licht der LEDs wird durch Anregungsfilter gefiltert und durch die Messkammer der Via1-Cassette™ geleitet. Das abgestrahlte Licht wird durch einen Emissionsfilter geleitet und das Signal von einer Kamera detektiert.

Die automatisierte Zellzählung mit der Via1-Cassette™ (NucleoCounter^® NC-200™ und NC-3000™) basiert auf unterschiedlichen Fluorophoren für die Bestimmung der Gesamtzellzahl (Acridinorange) und der Anzahl an toten Zellen (DAPI; 4′,6-diamidino-2-phenylindol). Bei Acridinorange handelt es sich um einen zellpermeablen Fluoreszenzfarbstoff, der nach der Bindung an zelluläres Material grün fluoresziert und für die Bestimmung der Gesamtzellzahl verwendet werden kann⁶.

Der NucleoCounter^® detektiert Acridinorange bei einer Anregung von 500 nm und einer Emission von 555/35 nm. Als zweites Fluorophor enthält die Via1-Cassette™ DAPI. Wird DAPI in einer geringen Konzentration (einige µg/ml) verwendet, so können nur tote Zellen mit einer permeabilisierten Membran angefärbt werden, lebende Zellen sind nicht-permeabel für DAPI. DAPI bindet an AT-reiche Cluster in der kleinen Furche von doppelsträngiger DNA und fluoresziert blau⁷

1. Phelan, M.C., Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol, 2007. Chapter 1: p. Unit 1.1.
2. Freshney, R.I., Basic Principles of Cell Culture. 2006: p. 1–22.
3. Nielson, L., G. Smyth, and P. Greenfield, Hemacytometer Cell Count Distributions: Implications of Non-Poisson Behavior. Biotechnology Progress, 1991. 7(6): p. 560-563.
4. Shah, D., et al., NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes. Cytotechnology, 2006. 51(1): p. 39-44.
5. Tennant, J.R., Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation, 1964. 2: p. 685-94. PMID: 14224649.
6. Robbins, E. and P.I. Marcus, Dynamics of Acridine Orange-Cell Interaction. I. Interrelationships of acridine orange particles and cytoplasmic reddening. J Cell Biol, 1963. 18: p. 237-50. PMID: 14079487.
7. Kubista, M., B. Akerman, and B. Nordén, Characterization of interaction between DNA and 4′,6-diamidino-2-phenylindole by optical spectroscopy. Biochemistry, 1987. 26(14): p. 4545-53. PMID: 3663606.