„Wir haben den NucleoCounter® NC-3000™ für die Quantifizierung des DNA-Gehalts verschiedener Säugerzelllinien eingesetzt. Der NC-3000™ zeigte eine genaue und präzise Bestimmung der Zellzyklusstadien im Vergleich zu durchflusszytometrischen Analysen (BD LSRII).“

Zellkultur

Verwendet wurden die Zelllinien U2OS (human osteosarcoma cell line, ECACC #92022711), CHO (Chinese hamster ovary cell line, ECACC #85050302) und Jurkat (human leukemia T cell line, ATCC #CRL-2570). Suspensionszellen (Jurkat) wurden bis zu einer Zelldichte von 5E5 Zellen/ml in RPMI + 6 % FCS kultiviert. Die Zellsuspension wurde in 6 T-Flaschen halbiert und mit oder ohne 10 µM Camptothecin (CPT) inkubiert. Nach 16h wurden die Zellen geerntet und auf den DNA-Gehalt hin untersucht. Die Proben wurden jeweils in Duplikaten analysiert. Adhärente Zelllinien (U2OS und CHO) wurden bis zu einer Konfluenz von 90 % in RPMI + 6 % FCS kultiviert. Die Zellen wurden mit Trypsin abgelöst und in 6 T-Flaschen aufgeteilt. Die T-Flaschen wurden ca. 24h bis zu einer Konfluenz von 75 % kultiviert und jeweils die Hälfte der Flaschen (3 für jede Zelllinie) wurden mit 10 µM CPT behandelt. Nach weiteren 16h wurden die Zellen geerntet und der DNA-Gehalt in Duplikaten analysiert.

Zellfärbung

Die Zellen wurden permeabilisiert und mit DAPI angefärbt. In Protokoll 1 (Fixed Cell Cycle Assay) wurden die Zellen durch Ethanol-Fixierung permeabilisiert, mit PBS gewaschen und anschließend mit DAPI angefärbt. Für Protokoll 2 (2-Step Cell Cycle Assay) wurden die Zellen durch saure Lyse permeabilisiert und ohne vorherige Waschschritte mit DAPI angefärbt.

Verwendete Geräte

Parallele Analysen wurden an denselben Zellproben durchflusszytometrisch (BD LSRII, BD Biosciences, 405 nm Laser) sowie bildgebend (NucleoCounter^® NC-3000™, Chemometec) für jeweils 10.000 Zellen durchgeführt. Am BD LSRII wurden die Analysen für DAPI im Pacific Blue Channel durchgeführt. Die Analysen am NC-3000™ wurden mit den vordefinierten Fixed Cell Cycle Assay und dem 2-Step Cell Cycle Assay durchgeführt.

Datenanalyse

Um den direkten Vergleich zwischen beiden Geräten zu erleichtern, wurden die jeweiligen Daten in FCS Format exportiert und mit FlowJo (Treestar) analysiert. Der DNA-Gehalt und die Zellzyklusverteilung von jeweils 10.000 Zellen wurden automatisiert erstellt und mit dem Zellzyklus-Algorithmus Watson Pragmatic (Version 7.6.5) analysiert. Jeder Datenpunkt in den ausgewerteten Plots repräsentiert den Mittelwert von 6 Zellproben (3 unabhängige Zellproben in Duplikaten).

Abbildung 1. Repräsentative Beispiele für Zellzyklus Histogramme mit dem BD LSRII und dem NC-3000™. Exponentiell kultivierte Jurkat, CHO und U2OS Zellen wurden durch Ethanol-Fixierung permeabilisiert, mit DAPI gefärbt und mittels Durchflusszytometrie (obere Reihe) und dem NC-3000™ (untere Reihe) auf ihren DNA-Gehalt hin untersucht. Die grünen, gelben und roten Flächen der Histogramme repräsentieren jeweils Zellen in der G1-, S und G2/M Phase. Für alle drei Zelllinien waren die erstellten Zellzyklus Histogramme vergleichbar zwischen dem BD LSRII und dem NC-3000™. In allen Fällen zeigten die Histogramme schmale G1-Peaks mit niedrigem Varianzkoeffizienten (CV).

Abbildung 2. Vergleich der der Zellzyklusanalyse mit dem BD LSRII und dem NC-3000™ unter Verwendung von fixierten Zellen mit Ethanol. Exponentiell kultivierte Zellen (untreated) und Camptothecin-behandelte Zellen (CPT treated) wurden durch Ethanol-Fixierung permeabilisiert, mit DAPI angefärbt und durch Durchflusszytometrie (rot) und Bildzytometrie (blau) auf den DNA-Gehalt untersucht. Die Balken repräsentieren den Anteil der Zellen in der jeweiligen Zellzyklus-Phase. Zellen mit einem DNA-Gehalt von weniger als 2C wurden in der Sub-G1 Phase dargestellt. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert von 6 Zellproben (3 unabhängige Zellproben in Duplikaten). Der Fehlerbalken entspricht der Standardabweichung. Für alle drei Zelllinien bestand eine hohe Übereinstimmung zwischen den durch die Durchflusszytometrie und die Bildzytometrie gemessenen Zellzyklusverteilungen. Die Genauigkeit und Präzision des NC-3000™ war vergleichbar mit dem BD LSRII. Der Anteil an G1-Zellen lag bei den unbehandelten Jurkat Zellen bei 41,5 ± 1,2% (BD LSRII) und bei 40,3 ± 1,2% (NC-3000™). Im Vergleich dazu lag der Anteil an G1-Zellen bei den CPT-behandelten Jurkat Zellen bei 10,8 ± 1,4% (BD LSRII) und bei 10,4 ± 0,2% (NC-3000™). Eine gute Vergleichbarkeit konnte auch bei den zwei anderen Zelllinien beobachtet werden. Die Daten zeigen, dass der NC-3000™ genaue und quantitative Untersuchungen des Zellzykluses ermöglicht.

Abbildung 3. Vergleich der der Zellzyklusanalyse mit dem BD LSRII und dem NC-3000™ unter Verwendung von fixierten Zellen durch saure Lyse. Exponentiell kultivierte Zellen (untreated) und Camptothecin-behandelte Zellen (CPT treated) wurden durch saure Lyse permeabilisiert, mit DAPI angefärbt und mit Durchflusszytometrie (rot) und Bildzytometrie (blau) auf ihren DNA-Gehalt hin untersucht. Die Balken repräsentieren den Anteil der Zellen in der jeweiligen Zellzyklus-Phase. Zellen mit einem DNA-Gehalt von weniger als 2C wurden in der Sub-G1 Phase dargestellt. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert von 6 Zellproben (3 unabhängige Zellproben in Duplikaten). Der Fehlerbalken entspricht der Standardabweichung. Für U2OS und Jurkat Zellen bestand eine hohe Übereinstimmung zwischen den durch die Durchflusszytometrie und die Bildzytometrie gemessenen Zellzyklusverteilungen. Die Genauigkeit und Präzision des NC-3000™ war vergleichbar mit dem BD LSRII. Der Anteil an S-Phase Zellen lag bei den unbehandelten Jurkat Zellen bei 44,9 ± 0,6% (BD LSRII) und bei 45,5 ± 0,7% (NC-3000™). Im Vergleich dazu lag der Anteil an S-Phase Zellen bei den unbehandelten U2OS Zellen bei 38,8 ± 1,8%  (BD LSRII) und bei 40,5 ± 1,1% (NC-3000™).

Die Fehlregulation des Zellzykluses ist eine charakteristische Eigenschaft von Krebszellen, deshalb ziehlen zahlreiche Chemotherapeutika auf die Zellzyklusprogression ab. Um eine robuste Zellzyklusanalyse durchzuführen und um genomische Anomalien, wie etwa Aneuploidie, zu detektieren, sind Systeme erforderlich, die eine genaue und präzise Quantifizierung des DNA-Gehalts liefern. Gegenwärtig steht die Durchflusszytometrie als Goldstandard für die Quantifizierung des zellulären DNA-Gehalts.

In dieser Studie wurde ein bildgebendes Zytometer (NucleoCounter® NC-3000™) und ein Durchflusszytometer (BD LSRII) hinsichtlich der Quantifizierung des DNA-Gehalts und damit der Zellzyklusverteilungen verglichen. Die Datensätze zeigten, dass für beide Geräte die Zellzyklusverteilung von verschiedenen Zelllinien sehr genau und präzise darstellt werden konnte. Die Übereinstimmung zwischen dem NC-3000™ und dem BD LSRII war sehr hoch. Es wurden zwei Protokolle für die Permeabilisierung der Zellen getestet, die Fixierung durch Ethanol und saurer Lyse. Die wird direkt mit der DAPI-Färbung kombiniert, wodurch das Protokoll sehr schnell und ohne Waschschritte durchgeführt werden kann. Wurden die Zellen mit den vordefinierten Protokollen im NC-3000™ gemessen, so konnte festgestellt werden, dass der CV-Wert des 2-Step Cell Cycle Assay etwas niedriger war als beim Fixed Cell Cycle Assay. Zusammenfassend ist festzustellen, dass der NC-3000™ Zellzyklusanalysen genauso präzise und reproduzierbar durchführen kann wie ein BD LSRII. Der Vorteil beim NC-3000™ besteht darin, dass die Messung und das Gerät selbst sehr kostengünstig und robust sind. Weiterhin lassen sich im Gegensatz zum BD LSRII die Zellzyklusphasen über das Fluoreszenzbild auch visuell evaluieren.