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Die Herstellung von CAR-T Zellen für adoptive Immuntherapien in der Klinik

26th April 2017 by Linda

Die Herstellung von CAR-T Zellen für adoptive Immuntherapien in der Klinik

– mit den NucleoCounter® Instrumenten

Der NucleoCounter® NC-202™ gewährleistet die robuste und akkurate Bestimmung der Zellzahl und der Viabilität von T Zellen bei der Produktion von CAR-T Zellen. Die einzigartige Via2-Cassette™ kombiniert die Probennahme, Anfärbung und das Laden der Zählkammer in einem einzigen Schritt. Die Erfassung und Analyse der Daten übernimmt hierbei automatisch die NucleoCounter® Software, wodurch eine hohe Reproduzierbarkeit erreicht wird.

Durch die Fluorophore Acridinorange und DAPI, welche sich bereits in der Via2-Cassette™ befinden, können T Zellen präzise detektiert werden, selbst wenn die Probe durch Erythrozyten oder Beads verunreinigt ist. Somit eignet sich das NucleoCounter® System perfekt für die Anwendung in der Zelltherapie.

NC-202Kostenlose Demo
Kostenvoranschlag

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Adoptive Immutherapien mit CAR-T Zellen

Einer der wichtigsten Fortschritte in zellulären Therapien sind Immuntherapien mit autologen T Zellen. Patientenspezifische T Zellen können genetisch verändert werden, sodass sie verschiedene T Zellrezeptoren oder den chimären Antigenrezeptor (CAR) auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Hierdurch wird die Spezifität und Toxizität der T Zellen im Hinblick auf verschiedene Erkrankungen stark erhöht, darunter Graft-versus-Host-Reaktion oder Krebs. Für eine Zelltherapie mit CAR-T Zellen werden die peripheren mononukleären Zellen (PBMC) des Patienten isoliert und die gewünschte T Zell Subpopulation aufgereinigt. In einem weiteren Schritt werden die T Zellen durch Transduktion mit Viren genetisch verändert. Die modifizierten T Zellen werden nun in großen Mengen expandiert und anschließend dem Patienten verabreicht. Mit dem NucleoCounter® NC-202™ ist es möglich, jeden einzelnen Schritt während der gesamten Herstellung und Produktion von CAR-T Zellen unter GMP-Standards zu überwachen (Abbildung 1).

Kontrolle des gesamten Herstellungsprozesses von der Leukapherese bis hin zur Produktfreigabe mit dem Nucleocounter® NC-202™

Abbildung 1: Kontrolle des gesamten Herstellungsprozesses von der Leukapherese bis hin zur Produktfreigabe.Mit dem Nucleocounter® NC-202™ können alle Schritte der Isolation, Aufreinigung und Produktherstellung von CAR-T Zellen mit ein und demselben Gerät lückenlos überwacht werden. Hierdurch werden durchgehend präzise und glaubwürdige Ergebnisse generiert.

Einfache und adaptierbare Protokolle erlauben die Zellzählung ausgehend von der Leukapherese sowie von aufgereinigten und expandierten CAR-T Zellen mit ein und demselben Gerät. Die Via2-Cassette™ vermeidet inakkurate Ergebnisse, welche sich mehrheitlich bei der Zellzählung unter Verwendung von Hellfeldmikroskopie ergeben, da die Fluorophore zur Zellzählung – Acridinorange und DAPI – bereits in der Via2-Cassette™ enthalten sind. Enthält das Probenmaterial noch Erythrozyten, wird durch die Verwendung eines Erythrozyten-Lysepuffers der quenchende Effekt des Hämoglobins verhindert. Anschließend können die Gesamtzellzahl und die Anzahl der toten Zellen einfach durch die Via2-Cassette™ mit Acridinorange und DAPI bestimmt werden. Von der Analyse werden Zellfragmente und Artefakte wie z.B. Mizellen, sowie zu kleine Events, z.B. Thrombozyten ausgeschlossen. Weiterhin haben auch magnetische Beads, welche oftmals zur Isolation von T Zellen verwendet werden, keinen Einfluss auf die Zellzählung mit dem NucleoCounter® NC-202™. Somit kann der NucleoCounter® NC-202™ durchgehend für den gesamten Produktionsprozess verwendet werden.

 

Application note (.PDF):

  • NucleoCounter® NC-202™ – Viability and cell count of mammalian cells

Datenmanagement und Datenpräsentation

Datenmanagement und Datenpräsentation

Abbildung 2: Datenmanagement und Datenpräsentation mit der begleitenden NC-View™ Software (für NucleoCounter® NC-202™) oder NucleoView™ Software (for NucleoCounter® NC-200™). Die Software erlaubt die einfache Kopplung zwischen dem generierten Fluoreszenzbild und den Diagrammen für eine präzise Kontrolle der Daten.

Die NucleoView™ Software erlaubt die visuelle Inspektion des Fluoreszenzbildes und hält die Option bereit, das Messergebnis zu verifizieren (Abbildung 2). Verschiedene Event Populationen können in den Punktediagrammen ausgewählt und überprüft werden, sowie wenn nötig von dem Endergebnis ausgeschlossen werden. Die adaptierten Protokolle können für zukünftige Messungen abgespeichert werden, wodurch die Reproduzierbarkeit entscheidend verbessert wird.

Der Nucleocounter® NC-202™ ist kalibriert und 21 CFR part 11 ready

 

Der NC-200™ ist kalibriert und 21 CFR part 11 ready

Abbildung 3: Automatisierte und standarisierte PDF Reporte. Die PDF Reporte gewährleisten die akkurate Dokumentation und Verifizierung der Messergebnisse durch elektronische Genehmigungen und Signaturen.

Die Herstellung von CAR-T Zellen für den Einsatz in klinischen Studien muss unter GMP-Richtlinien erfolgen, um eine sichere, personalisierte Therapie zu gewährleisten. Der NucleoCounter® NC-202™ kann einfach und unproblematisch in Labore unter GMP und 21 CFR Part 11 Standards implementiert werden. Vorgefertigte Protokolle für IQ/ OQ/ PQ gewährleisten eine konsistente Validierung. Standarisierte PDF Reporte, elektronische Signaturen und Prüfprotokolle sichern eine lückenlose Kontrolle (Abbildung 3). Mit der Via2-Cassette™ werden anwenderspezifische Ungenauigkeiten, welche beim Pipettieren, Färben und Zählen auftreten können, vollständig eliminiert. Somit werden robuste und äußerst präzise Ergebnisse generiert.

Literatur:

  • Singh, N., et al., Circulating apoptotic endothelial cells and apoptotic endothelial microparticles independently predict the presence of cardiac allograft vasculopathy. Journal of the American College of Cardiology, 2012. 60(4): p. 324-331.
  • Bournazou, I., et al., Apoptotic human cells inhibit migration of granulocytes via release of lactoferrin. The Journal of Clinical Investigation, 2009. 119(1): p. 20-32.
  • Brough, H.A., et al., IL-9 is a key component of memory TH cell peanut-specific responses from children with peanut allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2014. 134(6): p. 1329-1338.e10.
  • Buggert, M., et al., T-bet and eomes are differentially linked to the exhausted phenotype of CD8+ T cells in HIV infection. PLoS Pathogens, 2014. 10(7): p. e1004251.
  • Sandström, E., et al., Broad immunogenicity of a multigene, multiclade HIV-1 DNA vaccine boosted with heterologous HIV-1 recombinant modified vaccinia virus ankara. The Journal of infectious diseases, 2008. 198(10): p. 1482-1490.
  • Hartmann, S.B., et al., Investigating the role of surface materials and three dimensional architecture on in vitro differentiation of porcine monocyte-derived dendritic cells. PLoS ONE, 2016. 11(6): p. e0158503.
  • Wilson, G.A., et al., Human-specific epigenetic variation in the immunological leukotriene B4 RECEPTOR (LTB4R/BLT1) implicated in common inflammatory diseases. Genome Medicine, 2014. 6(3): p. 19-19.

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