Bildzytometrie versus Durchflusszytometrie – Ein Vergleich der Apoptotischen Ereignisse
Zellbiologische Forschung an der Universität von Kopenhagen
Der Zelltod durch Apoptose ist ein komplexer und streng regulierter Prozess, bei dem eine Zelle ihre eigene Zerstörung als Reaktion auf spezifische interne oder externe Stimuli orchestriert. Eine Dysregulation der Apoptose kann zu verschiedenen körperlichen Störungen wie Krebs und Autoimmunerkrankungen führen. Informationen über Apoptose werden in der Regel entweder durch Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie gewonnen.
Die Durchflusszytometrie liefert quantitative Informationen für Tausende von Zellen, ermöglicht aber keine Visualisierung der Zellen. Im Gegensatz dazu liefert die Fluoreszenzmikroskopie zwar visuelle Informationen, erlaubt aber keine einfachen quantitativen Messungen von großen Zellpopulationen. Die bildbasierte Zytometrie schließt die Lücke zwischen diesen beiden Technologien und ermöglicht die gleichzeitige quantitative Analyse und Visualisierung von Tausenden von Zellen.
Vergleich von Bild- und durchflusszytometrischer Bestimmung
Zellen reagieren auf apoptotische Signale, indem sie intrazelluläre Prozesse in Gang setzen, die zu charakteristischen physiologischen Veränderungen führen. Zu diesen Veränderungen gehören die Externalisierung von Phosphatidylserin an die Zelloberfläche, die Depolarisierung der Mitochondrienmembran, die Aktivierung von Proteasen, die Verdichtung und Fragmentierung des Kernchromatins, der Verlust der Zellmembranintegrität, sowie Schrumpfen der Zellen.
Wir haben drei verschiedene Marker untersucht, die üblicherweise zum Nachweis apoptotischer Zellen verwendet werden:
- Phosphatidylserin-Translokation – unter Verwendung von FITC-konjugiertem Annexin V-Peptid
- Depolarisation der Mitochondrienmembran – unter Verwendung von JC-1-Farbstoff
- Aktivierung von Caspase 3/7 – unter Verwendung von FAM-konjugiertem DEVDFMK-Peptid
Exponentiell wachsende Zellen (unbehandelt) und Camptothecin (CPT)-behandelte Zellen wurden mit FITC-Annexin V (ein Peptid, das externalisiertes Phosphatidylserin bindet), Hoechst-33342 und Propidiumiodid (PI) markiert.
- A) Die Fraktion der Annexin V-positiven und PI-positiven Zellen wurde durchflusszytometrisch (oberes Panel) und bildzytometrisch (unteres Panel) bestimmt. Die Diagramme stellen jeweils den Mittelwert von sechs Proben dar (drei unabhängige Proben, die in Doppelbestimmung analysiert wurden).
- B) Mikroskopische Aufnahme von CPT-behandelten CHO-Zellen. Das Mikroskopbild wurde durch Überlagerung von Bildern erstellt, die jeweils im blauen (Hoeschst-33342), grünen (FITC-Annexin V) und roten (PI) Kanal des NucleoCounter® NC-3000™ aufgenommen wurden. Pfeile zeigen die vier verschiedenen Populationen an, die in den Proben vorhanden sind. Die optische Vergrößerung des Geräts beträgt 2×.
Fazit
„Wir haben ein bildbasiertes Zytometer, den NucleoCounter® NC-3000™, zur Quantifizierung verschiedener Ereignisse im apoptotischen Prozess eingesetzt. Im Vergleich zu durchflusszytometrischen Analysen (BD LSRII) zeigte NC-3000™ eine genaue und präzise Bestimmung der Phosphatidylserin-Translokation, der Caspase 3/7-Aktivierung und der Depolarisation der Mitochondrienmembran.“
Olaf Nielsen, Professor an der Universität Kopenhagen.
Derzeit gilt die Durchflusszytometrie als Goldstandard für die Erfassung von quantitativen Informationen über große Zellpopulationen. In dieser Studie haben wir ein Bildzytometer, NucleoCounter® NC-3000™, und ein Durchflusszytometer, BD LSRII, in Bezug auf die Quantifizierung verschiedener Ereignisse im apoptotischen Prozess verglichen.
In der Vergleichsstudie haben wir die Phosphatidylserin-Externalisierung, den Kollaps des mitochondrialen Membranpotentials und die Aktivierung von Caspase 3/7 gemessen, allesamt anerkannte Marker für apoptotische Zellen.
Für alle drei Marker war das NC-3000™ bei der Quantifizierung apoptotischer Zellen im Vergleich zum BD LSRII genau und präzise. So fanden wir ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen den Fraktionen der apoptotischen Zellen, die von den beiden zytometrischen Systemen gemessen wurden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das NC-3000™ Bildzytometer eine neue Technologie darstellt, die eine genaue und quantitative Untersuchung von Veränderungen der Zellhomöostase in großen Populationen ermöglicht. Im Gegensatz zur herkömmlichen Durchflusszytometrie ermöglicht NC-3000™ dem Benutzer die Validierung der Probe durch Sichtprüfung der einzelnen Zellen.
Autoren
Olaf Nielsen, Anna Fossum und Soren Kjaerulff.