Ein Vergleich der DNA-Quantifizierung im Zellzyklus

Zellbiologische Forschung an der Universität von Kopenhagen

Der gebräuchlichste Ansatz zur Bestimmung des Zellzyklus basiert auf der Quantifizierung des zellulären Gehalts an DNA, der mit fluoreszierenden DNA-spezifischen Färbungen bestimmt werden kann, die Emissionssignale proportional zur DNA-Masse aufweisen. Die DNA-Färbung wird typischerweise an Zellen durchgeführt, die entweder mit nichtionischen Detergenzien greinigt oder mit Alkohol fixiert wurden. Traditionell ist die Durchflusszytometrie die Standardmethode der Wahl für die Durchführung von Zellzyklusanalysen.

Der Zellzyklus stellt den grundlegendsten und wichtigsten Prozess in eukaryontischen Zellen dar. Als geordnete Abfolge von Ereignissen, die in Zellwachstum und der Teilung in zwei Tochterzellen gipfelt, wird der Zellzyklus durch eine definierte zeitliche und räumliche Expression, Lokalisierung und Abbau mehrerer Zellzyklusregulatoren streng reguliert. Cycline und Cyclin-abhängige Kinasen (CDK) sind wichtige Kontrollschalter für den Zellzyklus, die dafür sorgen, dass sich die Zelle von der G1- zur S- oder von der G2- zur M-Phase bewegt.

In jeder Population verteilen sich die Zellen auf drei Hauptphasen des Zellzyklus: G1/G0-Phase (ein Satz gepaarter Chromosomen pro Zelle), S-Phase (DNA-Synthese mit einer variablen Menge an DNA) und G2/M-Phase (zwei Sätze gepaarter Chromosomen pro Zelle, vor der Zellteilung).
Es gibt einige Möglichkeiten, die Progression und Regulation des Zellzyklus zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine Vergleichsstudie zwischen Bild- und Durchflusszytometrie unter Verwendung von Zellen, die entweder durch Alkohol-Fixierung oder Säure-Lyse permeabilisiert wurden.

Vergleich von bildbasierter und durchflusszytometrischer Bestimmung des DNA-Gehalts

Histogramme, die den DNA-Gehalt von Jurkat-, CHO- und U2OS-Zellen zeigen. Die mit dem NucleoCounter® NC-3000™ erzielten Ergebnisse werden mit denen eines Durchflusszytometers verglichen.

Exponentiell wachsende Jurkat-, CHO- und U2OS-Zellen wurden durch Alkoholfixierung permeabilisiert, mit DAPI angefärbt und mittels Durchflusszytometrie (obere Reihe) und Bildzytometrie (untere Reihe) auf den DNA-Gehalt analysiert. Die erfassten Daten wurden wie im Abschnitt „Methoden“ des Poster-PDF beschrieben ausgewertet. Die grünen, gelben und cyanfarbenen Bereiche der Histogramme stellen G1-, S- bzw. G2/M-Zellen dar.

Für alle drei Zelllinien ähneln die mit dem Bildzytometer erhaltenen Histogramme des DNA-Gehalts denen, die mit dem Durchflusszytometer aufgenommen wurden. In allen Fällen zeigen die Histogramme schmale G1-Peaks mit niedrigem Varianzkoeffizienten (CV).

Siehe Vollständigen Datensatz im PDF-Poster

Conclusion

Dysregulation of the cell cycle is a distinct characteristic of cancerous cells and numerous chemotherapeutic drugs target cell cycle progression. To perform robust cell cycle analysis and to detect genomic abnormalities, such as aneuploidy, systems providing accurate and precise quantification of DNA content is required. Currently, flow cytometry is the gold standard for quantification of cellular DNA content.

In this study, we demonstrated that the NucleoCounter® NC-3000™ is highly accurate and precise for quantifying cellular DNA content when compared with the BD LSR II. Thus, we found a high degree of concordance between cell cycle distributions measured by the two cytometric systems.

Furthermore, we have compared two different methods for permeabilizing cells prior to DNA staining: Conventional alcohol fixation and a combination of mild acid and non-ionic detergent. The presented results show that the new acid lysis method allows for accurate quantification of DNA content. In general, cells lysed with acid provided lower coefficient variation (CV) of the G1 peak than cells fixed with alcohol.

In conclusion, cell cycle distributions quantified by image cytometry is accurate and precise when compared with flow cytometry, with the advantages of cost-effectiveness, robustness, and potential for morphological confirmation of the measured objects.

Authors

Olaf Nielsen, Anna Fossum and Soren Kjaerulff.