Schnelle Phänotypisierung von Erbkrankheiten mittels Bildzytometrie

Charakterisierung für Gentherapie am Universitätsklinikum Aarhus

Die Phänotypisierung von Zellen von Patienten mit Erbkrankheiten kann ein sehr leistungsfähiges Werkzeug sein, um verschiedene Aspekte einer Krankheit, einschließlich der Ätiologie, zu verstehen. An der Universität Aarhus haben Fernandez und ihre Mitarbeiter ein neuartiges Programm zur Zellphänotypisierung mit dem NucleoCounter® NC-3000™ advanced Bildzytometer entwickelt, um zelluläre und mitochondriale Parameter in menschlichen dermalen Fibroblasten (HDFs) zu charakterisieren1. Die Autoren verwenden HDFs als Modell, um das neue Programm zur Phänotypisierung von Zellen zu entwickeln.


Um das Modell in Patientenproben zu validieren, verwenden sie HDFs von Patienten mit „sehr langkettigem Acyl-CoA-Dehydrogenase-Mangel“ (VLCADD), sowie die NHDF-Zelllinie als Kontrolle. Eine Beeinträchtigung des VLCAD-Gens führt zu einer fehlerhaften Fettsäure-β-Oxidation, die einen Anstieg von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und eine mitochondriale Dysfunktion verursacht. Patienten, die von VLCADD betroffen sind, zeigen eine Reihe von Symptomen, die vom Schweregrad der Erkrankung abhängen.


Das Programm von Fernandez spart Zeit und benötigt für jede Analyse nur geringe Mengen an Gewebe. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um andere Zellphänotypisierungsprotokolle für die Analyse von kundenspezifischen Parametern zu entwickeln.

Eine Probe, drei Parameter, analysiert mit schnellen und einfach zu bedienenden Assays

Die Autoren verwenden den NucleoCounter® NC-3000™, um drei Parameter von HDFs zu untersuchen:

1. Zellzahl und Zelllebensfähigkeit
The Zellzahl-und-Viabilitäts-Assay liefert Informationen über Zellzahl und Viabilität und wird in zwei Schritten durchgeführt:

  1. Zur Bestimmung der Gesamtzellkonzentration werden die Zellen lysiert und anschließend mit 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) angefärbt, wodurch alle Zellkerne fluoreszieren.
  2. Die Anzahl der viablen Zellen wird durch direkte Zugabe von DAPI zu unbehandelten Zellproben und deren Quantifizierung bestimmt. Da DAPI die intakte Zellmembran nicht durchdringen kann, färben nur tote Zellen, die eine kompromittierte Membran haben, positiv für DAPI.

Die Viabilität wird nach der folgenden Formel berechnet: Lebensfähigkeit% = (Gesamtzellzahl – Anzahl toter Zellen) / Gesamtzellzahl × 100.

2. Gesamter zellulärer Redoxzustand

Das Zellvitalitäts-assay gibt Auskunft über den Thiol-Redox-Status von Zellen und damit über den gesamten zellulären Redox-Zustand, da die Prozesse miteinander verknüpft sind. Dieser Assay verwendet das zellpermeable Fluorophor VitaBright-48™, das bei Reaktion mit reduzierten Thiolgruppen auf Proteinen fluoresziert.

3. Mitochondriales Membranpotential

Das Mitochondriales Potential-Assay bestimmt das mitochondriale Membranpotenzial (MMP), das für verschiedene Aspekte der mitochondrialen Funktion entscheidend ist und daher Informationen über die gesamte mitochondriale Integrität der Zellen liefert. Das Assay verwendet JC-1, ein Fluorophor, das rot fluoresziert, wenn es in den Mitochondrien gesunder Zellen Aggregate bildet, und grün fluoresziert, wenn es in apoptotischen Zellen im Zytosol verteilt ist.

Plug-and-play-Assays für Phänotypisierungsparameter mit dem NucleoCounter® NC-3000™

Das Flussdiagramm visualisiert das Programm zur Phänotypisierung in dem Artikel von Fernandez2. Da die ersten Vorbereitungsschritte für alle drei Assays gleich sind, muss nur eine Probe vorbereitet werden.

Ungefähr 1,6 × 106 HDFs werden in eine Standard-T75-Zellkulturflasche ausgesät. Nach 24 Stunden werden die HDFs mit 0, 2 oder 4 mmol/l H2O2 für 1, 1,5 bzw. 2 Stunden behandelt. Anschließend werden die HDFs durch Trypsinierung geerntet und in einem 15 ml Falcon-Probenröhrchen gesammelt. Vier Aliquots werden für Zellzahl-, Viabilitäts-, Thiol-Redox-Status- und Mitochondrien-Assays entnommen und gemäß den einzelnen Assay-Protokollen gefärbt.

Die Proben werden mit dem NC-Slide A2™ mit Standardprotokollen für den NucleoCounter® NC-3000™ analysiert.

In den Flows werden die Zellen kultiviert, geerntet und auf Zellzahl und Viabilität, Thiol-Redox-Status und mitochondriales Potenzial analysiert.
Balkendiagramme von H2O2-behandelten Zellen, die Zellzahlen und Fluoreszenzintensität zeigen.

Zur Validierung des Protokolls zur Zellphänotypisierung werden HDF-Gewebeproben von VLCADD-Patienten mit H2O2 behandelt und ausgewertet.

Oxidativer Stress ist schädlich für Zellen, daher führt die H2O2-Behandlung zu einer Abnahme sowohl der Zellzahl als auch der Viabilität (A)2. Dies korreliert mit einer starken Reduktion der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von VitaBright-48™, d. h. der Menge der reduzierten Thiolen (Bild B). Dies ist zu erwarten, da H2O2 in der intrazellulären Umgebung eine Oxidation verursacht. Außerdem induziert die H2O2-Behandlung einen deutlichen Anstieg der Anzahl der Zellen, die ihr mitochondriales Membranpotenzial verloren haben, gemessen am MFI von JC-1 (C), was auf einen Verlust der mitochondrialen Funktion und die Einleitung der Apoptose in H2O2-behandelten Zellen hindeutet.

Die NC-3000™-Assays, die für dieses Zellphänotypisierungsprotokoll ausgewählt wurden, identifizieren also präzise zelluläre und mitochondriale Veränderungen unter Umständen, die pathophysiologische Bedingungen mit erhöhten ROS-Werten nachahmen.

Zelluläre Phänotypisierung von HDFs aus VLCADD-Patientenproben

Als nächstes testen Fernandez und ihr Team die Reaktion von HDFs von Patienten, die entweder an einer leichten oder einer schweren Form von VLCADD leiden. Eine hohe H2O2-Konzentration verursacht eine signifikante Abnahme der Viabilität in Fibroblasten von Patienten mit beiden Formen der Erkrankung im Vergleich zur Kontrolle. Die Ergebnisse legen nahe, dass Zellen mit defektem VLCAD anfälliger für oxidativen Stress sind. Interessanterweise gibt es keinen Unterschied im intrazellulären Redox-Zustand zwischen gesunden und kranken Fibroblasten, was mit dem Cell Vitality Assay gezeigt wurde.

Fibroblasten von Patienten mit der milden Form der Erkrankung zeigen im Vergleich zur Kontrolle eine erhöhte Anzahl von Zellen, die ihr MMP verlieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll zur Zellphänotypisierung Ähnlichkeiten und Unterschiede in der Reaktion auf oxidativen Stress sowohl bei gesunden als auch bei ungesunden HDFs identifizieren kann, was es zu einer sehr effizienten Methode zur Überwachung der mitochondrialen Funktion in HDFs von VLCAD-Patienten macht.

Verwendung der Bildzytometrie zur Entwicklung neuartiger Protokolle zur Zellphänotypisierung

Der NucleoCounter® NC-3000™ wird mit mehreren zusätzlichen apoptosis assays, einem Zellzyklus-assay und einem anpassbaren Modul namens FlexiCyte™, für die Analyse von bis zu vier verschiedenen benutzerdefinierten fluoreszierenden Biomarkern geliefert. Jeder dieser Plug-and-Play-Assays kann bei Bedarf in andere Zell-Phänotypisierungs-Assays integriert werden. Bei Zellphänotypisierungsprotokollen mit dem NC-3000™ muss nur eine Probe vorbereitet werden, was Zeit spart, und weniger Probenvolumen für jedes durchgeführte Phänotypisierungsexperiment erfordert.

Verweise

  1. P Fernandez-Guerra, M Lund, TJ Corydon et al.: Application of an Image Cytometry Protocol for Cellular and Mitochondrial Phenotyping on Fibroblasts from Patients with Inherited Disorders. JIMD Rep. 2016; 27:17-26.
  2. Open access to publication and figures through ResearchGate.