NEU DebrisIndex™: Zur Überwachung von Produktionsabläufen
Mit dem DebrisIndex™ können Sie Ihre Produktionsabläufe und Prozessparameter im Bioreaktor lückenlos überwachen. Der DebrisIndex™ definiert die Menge an Zelltrümmern, relativ zur Zellkonzentration. Implementieren Sie den DebrisIndex™ als zusätzlichen Prozessparameter, um Ihre Zellkultur zum richtigen Zeitpunkt zu ernten oder anderweitig zu verwenden. Der DebrisIndex™ ermöglicht Ihnen zusammen mit der Anzahl der lebenden und der toten Zellen einen Überblick über die Vitalität Ihrer Zellkultur.
Der DebrisIndex™ mit dem NucleoCounter® NC-202™
Funktionsweise des DebrisIndex™
Durch herkömmliche automatisierte Zellzählgeräte ist es nicht möglich, zwischen lebenden und nicht mehr lebensfähigen (aber noch nicht toten) Zellen zu unterscheiden. Zu diesen nicht-vitalen Zellen gehören z.B. apoptotische Zellen oder Zellen ohne Zellkern. Zelltod-Marker, wie z.B. Trypanblau färben diese Zellen nicht an, was zur Überschätzung der Viabilität der Zellkultur führt.
Für die Färbung werden die Fluorophore Acridinorange (AO) und 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) verwendet, welche Zellmembranen bzw. abgestorbenen Zellkerne anfärben. Das automatisierte Zellzählgerät NucleoCounter® NC-202™ verwendet die NC-View™ Software zur Detektion und Analyse der Färbeintensitäten. Hierdurch kann die Anzahl an lebenden Zellen, toten Zellen sowie Zelltrümmer bestimmt werden. Weitere nützliche Parameter sind u.a. Viabilität, Zellkonzentration, Zelldurchmesser, der Aggregationsfaktor und der DebrisIndex™.
Nehmen wir an, dass in einer Zellkultur insgesamt 9 Zellen vorhanden sind. Ein herkömmliches automatisiertes Zellzählgerät wird in dieser Zellkultur 4 lebende (gelbe Kerne, siehe Abbildung oben) und 2 tote Zellen detektieren, abhängig von den Einstellungen des Algorithmus und dem Cut-off der Zelldefinition und Empfindlichkeit. Bestimmte Software-Algorithmen würden dieselbe Probe analysieren und 5 tote Zellen detektieren (grauer Kern sowie die unregelmäßig geformten Zellen). Der NucleoCounter® NC-202™ detektiert über die NC-View™ Software die Granularität der toten Zellen. Somit kann er für die Zellkultur in diesem Beispiel 1 tote Zelle (runde Zelle, grauer Kern) und 4 Zelltrümmer (unregelmäßig geformte Events) detektieren. Dies ergibt einen DebrisIndex™ von 80 (DebrisIndex™ = Anzahl der Zelltrümmer pro allen Zellen).
Zusammengefasst bedeutet dies, dass der NucleoCounter® NC-202™ präzise zwischen a) intakten lebenden Zellkernen; b) toten Zellkernen und c) allen Events, die einer Zelle ähneln, aber keinen intakten Zellkern haben und somit als Zelltrümmer detektiert werden, unterscheiden kann.
Überwachung von Produktionsabläufen
Ein direktes Problem stellt die Überschätzung der Anzahl lebender Zellen zwar nicht dar, aber Sie erhalten wesentlich zuverlässigere Ergebnisse, wenn Sie die tatsächliche Anzahl apoptotischer Zellen und Zellen ohne Zellkern kennen.
Implementieren Sie den DebrisIndex™ als zusätzlichen Prozessparameter, um Ihre Zellkultur zum richtigen Zeitpunkt zu ernten oder anderweitig zu verwenden. Der DebrisIndex™ vermittelt Ihnen zusammen mit der Anzahl der lebenden und der toten Zellen einen Überblick über die Vitalität Ihrer Zellkultur.
CHO Zellen im Bioreaktor
Die Abbildung zeigt die Anzahl der lebenden und der toten Zellen sowie den DebrisIndex™ einer CHO-Zelllinie während einer 14-tägigen Kultur in einem Bioreaktor (Fed-Batch-Kultur).
Die Zellzahl nimmt über 8 Tage im Verlauf zu (Plateauphase). Die Zahl der toten Zellen nimmt während der gesamten Kulturdauer zu, bleibt aber aufgrund der guten Kulturbedingungen niedrig. Der DebrisIndex™ lässt sich erst ab dem 12. Tag nachweisen, hier steigt er langsam an. Bei zu hoher Zelldichte nimmt die Proliferationsrate ab und die Zellkultur kann absterben.
HEK293 Zellen in Kultur
Die Abbildung zeigt die Anzahl der lebenden und der toten Zellen sowie den DebrisIndex™ einer HEK293-Zelllinie während einer 18-tägigen Kultur unter Hungerbedinungen.
Die Anzahl toter Zellen und der DebrisIndex™ korreliert mit einer Abnahme der Anzahl lebender Zellen. Dies ist der Fall, da das Zellkulturwachstum sein Maximum erreicht und Zelltrümmer/ Nährstoffmangel das weitere Zellwachstum hemmen.
Nachweis von Hefe-Infektionen in Zellkulturen
Wenn das Wachstum einer Zellkultur gut definiert ist, kann der DebrisIndex™ zum Nachweis von Hefeinfektionen verwendet werden. Hefezellen werden von der NC-View™ Software als Zelltrümmer erkannt. Ein ungewöhnliches Auftreten oder große Schwankungen im DebrisIndex™ während eines Standardproduktionslaufes können auf eine Kontamination hinweisen.
Wenn der DebrisIndex™ nur minimal und in einem wiedererkennbaren Muster ansteigt, deutet dies auf einen erfolgreichen Produktionsprozess hin.
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