Mit den NucleoCounter® Instrumenten
Fluoreszenzfarbstoffe erlauben eine präzise Zellzahlbestimmung durch Kernfärbung selbst in Aggregaten
Die herkömmliche Lichtmikroskopie erlaubt, Objekte aufgrund ihrer Form und ihrer Schattenbildung zu erkennen und abzugrenzen (Abbildung 1). Jedoch können Zelltrümmer und Kontaminationen bei dieser Art der Zellzählung nicht sauber von Zellen unterschieden werden. Falls es sich um ein Zellaggregat handelt und sich die Außenkontur der Zellen überschneidet, ist es mit lichtmikroskopischen Aufnahmen nahezu unmöglich, einzelne Zellen akkurat voneinander zu unterscheiden.
Die NucleoCounter® Instrumente verwenden zur Zellzählung die Fluoreszenzfarbstoffe Acridinorange und DAPI, welche mit einer starken Affinität spezifisch an die DNA binden und Zellkerne kontrastreich anfärben. Sollen kleinere Zellaggregate ausgezählt werden, so können Zellkerne sehr viel besser segmentiert und analysiert werden als der äußere Umriss der Zellen (Abbildung 1). Darüber hinaus sind im Gegensatz zum Lichtmikroskop unter dem Fluoreszenzmikroskop Kontaminationen und Artefakte nicht sichtbar.
Abbildung 1: Vergleich zwischen Lichtmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie bei der Zählung von Zellen in Aggregaten. Artefakte, sichtbar im Lichtmikroskop (Hellfeldmikroskopie) sind in einem Fluoreszenzmikroskop nicht sichtbar. Gegenüber dem Lichtmikroskop ist die fluoreszente Zellkernfärbung mit Acridinorange spezifischer und der Kontrast stark erhöht. Hierdurch können einzelne Zellen in einem Aggregat präziser identifiziert und segmentiert werden. Die Aufnahmen zeigen denselben Bildausschnitt im Hellfeld und unter Verwendung eines Fluoreszenzfilters.
Die NC-View™ Software detektiert einzelne Zellen in kleinen Aggregaten
Das Herzstück des Nucleocounter® NC-202™ Systems stellt die NC-View™ Software dar. Der leistungsstarke Bildalgorithmus gewährleistet eine akkurate Detektion und Analyse von einzelnen Zellen in kleineren Aggregaten. Hierbei werden die Spitzenintensitäten und zugehörigen Höhenprofile der Fluoreszenbilder verwendet, um verschiedene Objekte von dem Hintergrundsignal zu unterscheiden. Auch wenn Zellen nahe beieinander liegen und sich ihre Höhenprofile überlappen, sind diese immer noch durch ihre separaten Spitzen voneinander zu unterscheiden (Abbildung 2). Die Intensitätsparameter der segmentierten Zellen können zur besseren Visualisierung und Validierung der Daten graphisch in der NC-View™ Software dargestellt werden.
Abbildung 2: Automatisierte Bildanalyse mit der NC-View™ Software. Direkt nach der Bildaufnahme am NucleoCounter® NC-202™ werden die Bildinformationen durch den Bildalgorithmus analysiert. Die Intensitätsspitzen werden verwendet, um einzelne Zellen selbst in Zellaggregaten zu segmentieren. Lebende und tote Zellen, sowie die Segmentierung von Zellen in Aggregaten, können an der Benutzeroberfläche visualisiert werden.
Die NucleoCounter® Instrumente definieren einen Aggregationsfaktor
In einem Zellaggregat mit weniger als fünf Zellen können einzelne Zellen immer noch akkurat voneinander unterschieden werden. In stärker aggregierten Zellproben mit Zellen, die sich gegenseitig überlappenden, wird es schwieriger eine akkurate Zellzahlbestimmung durchzuführen. Manuelle und automatisierte Zellzählgeräte, die auf der lichtmikroskopischen Identifizierung von einzelnen Zellen beruhen, können keine detaillierte Aussage über die Aggregation der Probe treffen. Im Gegensatz dazu stellen die NucleoCounter® Instrumente die Aggregation prozentual dar. Basierend auf diesem Ergebnis kann der Anwender entscheiden, ob ein spezialisierter Assay für aggregierte Zellen verwendet werden sollte.
Präzise Zellzählung von stark aggregierten Zellen mit den NucleoCounter® Instrumenten
Verschiedene Zelltypen (z.B. primäre Zellen, HEK, MCF-7, HepG2, iPSC), sowie Zellen, kultiviert in Sphäroiden und auf Microcarriern bilden ausgeprägte Zellklumpen, welche nur sehr schwer enzymatisch oder mechanisch vereinzelt werden können. Zellen in solch großen Aggregaten überlagern einander und lassen nur eine sehr ungenaue Zellzahlbestimmung zu. Die NC-View® Software bietet die Möglichkeit, trotz starker Aggregation die Zellzahl und die Viabilität zuverlässig zu bestimmen (Abbildung 3). Über den Aggregated Cells Assay wird die Zellprobe mit einem Lysepuffer vorbehandelt. Dieser löst die Aggregate auf und permeabilisiert die Zellmembran für die Zellkernfärbung mit DAPI. Da sich tote Zellen durch fehlende Zelladhäsionskräfte außerhalb der Aggregate befinden, kann die Anzahl der toten Zellen direkt aus der nicht-lysierten Zellprobe bestimmt werden. Somit erlauben die NucleoCounter® Instrumente eine präzise und einfache Zellzahlbestimmung selbst in stark aggregierten Zellproben.
Abbildung 3: Bestimmung der Zellzahl und der Viabilität von aggregierten Zellen im Lysepuffer System. In zwei einfachen Schritten wird die Gesamtzellzahl und die Anzahl an toten Zellen bestimmt.
Folge uns