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Zellzyklus-Analyse mittels bildgebender Zytometrie

– Zellzyklus in zwei Schritten mit dem NucleoCounter® NC-3000™

Der Zellzyklus und die Zellteilung sind fundamental wichtige Prozesse in eukaryotischen Zellen. Mit dem Zellzyklus-Assay im NucleoCounter® NC-3000™ kann in zwei einfachen Schritten ein vollständiges Zellzyklus-Profil von Säugetierzellen in weniger als 10 Minuten erstellt werden. Durch die Verwendung des Fluorophors DAPI wird die DNA-Färbung quantifiziert. Die Ergebnisse werden nutzerfreundlich in einem Zellzyklus-Histogramm präsentiert.

Advanced image cytometer - NucleoCounter NC-3000

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Das Wichtigste:

  • Schnelle und einfache Messung der Zellzyklus-Phasen
  • Analyse und Datenpräsentation in nur einem Schritt
  • Reproduzierbare Ergebnisse
  • Keine RNAase notwendig
  • Keine Kalibrierung
  • Datenanalyse im Plotmanager

 

Zellzyklus-Assay in zwei Schritten

In zwei einfachen Schritten werden die Zellen im Zellzyklus-Assay abgelöst, permeabilisiert, vereinzelt und die Zellkerne homogen mit DAPI angefärbt. Für diesen Assay sind weder Trypsin-Vorbehandlung noch Waschschritte oder Zentrifugation nötig. Der gesamte Assay dauert weniger als 10 Minuten.

Zellzyklus an fixierten Zellen

Für diesen Assay können die vorbereiteten Zellen über mehrere Wochen in Ethanol gelagert werden. Anschließend werden die Zellen gewaschen und die Zellkerne mit DAPI angefärbt.
Application Note (.PDF):

  • Two Step Cell Cycle Assay
  • Cell Cycle Assay using fixed cells

Zellzyklus-Analyse mit dem NC-3000™

 

Mit dem NucleoCounter® NC-3000™ kann der Zellzyklus einfach und schnell bestimmt werden. Die Zellen werden mit Lysepuffer, DAPI und Stabilisierungspuffer gemischt und die Probe mit dem NucleoCounter® NC-3000™ gemessen. Die NucleoView™ Software zeigt über den Plotmanager ein Zellzyklus-Histogramm an, in welchem die Gates für die einzelnen Zellzyklus-Phasen Sub-G1, G1/G0, S und G2/M definiert werden können. Mit der FlexiCyte™ Software kann die Zellproliferation auch über fluoreszent gekoppeltes BRdU oder EdU detektiert werden.

Zellzyklus mit DAPI

Der Zellzyklus-Assay im NucleoCounter® NC-3000™ verwendet das Fluorophor DAPI für den Nachweis des DNA-Gehaltes. DAPI bindet gezielt an doppelsträngige DNA. Im Gegensatz dazu bindet Propidiumiodid, welches oftmals für Zellzyklus-Analysen verwendet wird, neben DNA auch RNA. Wird  DAPI verwendet, muss somit keinerlei RNAase verwendet werden. Mit dem NucleoCounter® NC-3000™ wird der DNA-Gehalt quantifiziert und anschließend die einzelnen Stadien des Zellzykluses detektiert.

Nach der Probenvorbereitung werden die Proben entweder in die NC-Slide A2™ oder die NC-Slide A8™ für die Messung im NucleoCounter® NC-3000™ geladen. Der NucleoCounter® NC-3000™ analysiert automatisch die Fluoreszenzbilder und stellt die Verteilung des DNA-Gehaltes in einem Zellzyklus-Histogramm dar.

Cell Cycle Assay Princilple - NC-3000

Die Ergebnisse im Plotmanager

Cell Cycle Analysis - Results presented in Plot Manager

Abbildung: U2OS Zellen wurden mit (untere Reihe) und ohne (obere Reihe) Etoposid inkubiert. Der DNA-Gehalt wurde über den Zellzyklus-Assay mit dem NucleoCounter® NC-3000™ analysiert. Die Punktediagramme und Histogramme wurden mit der NucleoView™ Software erstellt. Die Gates und Marker in den dargestellten Plots wurden verwendet, um die verschiedenen Zellzyklus-Phasen voneinander abzugrenzen. In diesem Beispiel zeigte die Behandlung mit Etoposid einen Anstieg von Zellen in der Sub-G1 Phase. In dem farbigen Histogramm wurden die Histogramme beider Proben überlagert.

Geräte

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