Neurowissenschaft

Multiple Kultur-Systeme – eine Zählmethode

In der Neurowissenschaft werden unterschiedliche zellbasierte Modelle verwendet, um das zentrale und das periphere Nervensystem zu untersuchen, z. B. das Gehirn und die lokalen Neuronen eines Gewebes.

Die Schlüsselfragen, mit denen wir uns beschäftigen, sind die der neuronalen Entwicklung, des neuronalen Abbaus und der Regeneration sowie der Frage, welche Signale das neuronale System nicht nur lokal, sondern auch aus der Perspektive des gesamten Organismus beeinflussen, insbesondere mit dem Aufkommen der Mikrobiomforschung.

Diese Forschungsbereiche tragen zum Verständnis der physischen Funktionsweise des Nervensystems und ihrer Auswirkungen auf den Organismus bei.

Neuronale Zellquellen und Kultursysteme

Blaue Zellen, die in einer blauen Substanz herumschwimmen
Die Arbeit an neuronalen Zellen in Kultur erfolgt seit langem durch die Entnahme einer Probe von Säugetiergehirngewebe und dessen Kultivierung in einem physiologisch relevanten Medium in einer Kulturschale. Ob Sie nun mit reifen neuronalen Zellen aus dem Gehirn oder mit neuronalen Stammzellen (NSCs) aus der subventrikulären Zone (SVZ) des Vorderhirns arbeiten, der wahre Vorteil besteht darin, dass Sie tatsächliche Neuronen studieren können, die vor kurzem die Gehirnfunktion in einem ganzen Organismus unterstützt haben. Es ist jedoch schwierig, solche Kulturen über einen längeren Zeitraum zu züchten, da die neuronale Nische nur schwer wiederhergestellt werden kann und die Neuronen beim Sezieren und Einsetzen in die Kultur oft beschädigt werden. Zusätzlich könnten sie im Laufe der Zeit mit Verunreinigungen kontaminiert werden, da einige Kultursysteme mehrere Monate lang laufen, um die hirnähnlichen Strukturen in vitro reifen zu lassen und zu testen. Viele Wissenschaftler ziehen es vor, mit menschlichen Zellen statt mit tierischen Zellen zu arbeiten, was den Zugang zum Arbeitsmaterial erheblich einschränkt.
Eine alternative Zellquelle sind die neuralen Vorläuferzellen (NPCs), die aus der neuralen Differenzierung von embryonalen oder induzierten pluripotenten Stammzellen (ESCs bzw. iPS-Zellen) gewonnen werden. Diese Kulturen werden häufig in Sphäriodkulturen1, den so genannten Neurosphären, gezüchtet und können durch regelmäßiges Passagieren aufrechterhalten werden. Dabei werden die Sphären dissoziiert, verdünnt und wieder in Kultur gesetzt. Die weitere Differenzierung in reife Nervenzellen bietet grenzenloses Material für die Untersuchung der Funktion von Nervenzellen und identifiziert Faktoren, die ihre Reaktionen auf Reize verändern können.

Die Differenzierung in ein verfeinertes in vivo-relevantes neuronales System wurde durch die Entwicklung von zerebralen Organoiden oder Mini-Gehirnen durch das Duo Lancaster-Knoblich enorm vorangetrieben2. Diese komplexen neuronalen Strukturen enthalten Zellen aus mehreren verschiedenen Hirnregionen und sind als repräsentatives Modell des Gehirns einzigartig.

In der Neurowissenschaftlichen Forschung gibt es viele verschiedene Kultursysteme, angefangen bei einfachen 2D-Kulturen von adhärenten Neuronen bis hin zu 3D-Kulturen von zerebralen Organoiden. Es handelt sich jedoch nicht um einen einfachen Wechsel von 2D zu 3D, sondern um eine schrittweise Entwicklung der Kultursysteme von Neurosphären und neuralen Aggregaten über neurale Rosetten bis hin zu kortikalen Sphäroiden und zerebralen Organoiden. Es handelt sich jedoch nicht um einen einfachen Wechsel von 2D zu 3D, sondern um eine schrittweise Entwicklung der Kultursysteme von Neurosphären und neuralen Aggregaten über neurale Rosetten bis hin zu kortikalen Sphäroiden und zerebralen Organoiden.

Studien zu Nervenkrankheiten

Traditionell ging man davon aus, dass das Nervengewebe des zentralen Nervensystems (ZNS) nach einer Verletzung nicht in der Lage ist, sich zu reparieren oder zu regenerieren3. In den letzten Jahrzehnten, seit der Entdeckung von NSCs und NPCs, hat sich gezeigt, dass diese Systeme eine erhebliche Plastizität aufweisen und für eine Vielzahl von Studien eingesetzt werden4,5:

  1. Neurotoxizitätstests
  2. Validierung und Erprobung von Arzneimittel-Targets
  3. Erstellung von Modellen zu Gehirnentwicklung und Verletzungen
  4. Erstellung von Krankheitsmodellen
  5. Zelluläre Therapien zur Behandlung von ZNS-Erkrankungen
  6. Neuronale Gewebezüchtung (Gentherapie) und Reparatur
  7. Personalisierte Medizin

Forscher untersuchen Zelltherapien für Krankheiten wie das Parkinson-Syndrom, Rückenmarksverletzungen, Alzheimer und Multiple Sklerose. Außerdem versuchen sie, die Ätiologie und das Fortschreiten neuer Krankheiten wie der Mikrozephalie bei Neugeborenen, die durch das Zika-Virus ausgelöst wird, zu verstehen. Sie wenden sich dendritischen Impfstoffen und anderen zellbasierten Immuntherapien zu, um das Glioblastom zu bekämpfen. Außerdem erforschen sie Möglichkeiten der personalisierten Medizin, beispielsweise die Kombination der Erzeugung von iPS-Zellen aus Patientenproben mit Gen-Editing und die Verwendung der differenzierten Zellen zur Behandlung genetischer Krankheiten.

Lösungen zur Kontrolle Ihrer neuronalen Zellkulturen

Beim Assay für aggregierte Zellen werden die Zellen lysiert und anschließend die Gesamtzellzahl bestimmt. Für die Zählung der toten Zellen färben Sie die Probe vor der Zählung mit DAPI.

Eine der ersten und grundlegendsten Herausforderungen bei der Kultivierung neuronaler Zellen ist die Beibehaltung einer strengen Kontrolle der Zellzahl sowohl bei der Einrichtung des Kultursystems als auch bei der Pflege, Differenzierung und Prüfung. Insbesondere bei komplexen sphäroiden oder organoiden Systemen, die über einen längeren Zeitraum reifen müssen, sind Sie in hohem Maße davon abhängig, dass Sie den Prozess auf dem Weg dorthin kontrollieren können.

Da neuronale Zellen oft in Aggregaten oder komplexeren 3D-Kulturen wachsen, kann es sehr schwierig sein, sie für eine genaue Zählung zu dissoziieren.

Der automatisierte Zellzähler NucleoCounter® NC-202™ zählt zuverlässig Säugetierzellen aus komplexen Proben und bestimmt deren Viabilität. Selbst wenn die Probe Trümmer enthält, erhalten Sie mit dem NC-202™ unvergleichlich reproduzierbare Daten über Proben, Zelltypen, Benutzer und Geräte hinweg.

Der automatisierte Zellzähler bietet Zählanwendungen speziell für Zellen, die in Suspension oder adhärent, auf Mikroträgern und in organoiden Kulturen wachsen. Unsere Reagenzien zum Entklumpen gewährleisten außerdem schnelle und konsistente Verfahren zur Trennung von Zellen in Aggregaten und Scaffolds.

Mit dem zuverlässigen NC-View™-Software-Algorithmus und dem einzigartigen Via2-Cassette™-Probenahmegerät, das menschliche Einflüsse ausschließt, können Sie sich auf Ihre experimentelle Datenerfassung konzentrieren, da Sie sich auf Ihren initialen Zellkulturaufbau verlassen können.

Verweise

  1. V Tropepe, S Hitoshi, C Sirard, et al.: Direct neural fate specification from embryonic stem cells: a primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a default mechanism. Neuron. 2001 Apr;30(1):65-78.
  2. MA Lancaster, M Renner, C-A Martin, et al.: Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013 Sep 19;501(7467):373-9.
  3. BA Reynolds, RL Rietze: Neural stem cells and neurospheres—re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2005; 2, 333–336.
  4. CG Gross: Neurogenesis in the adult brain: death of a dogma. Nature Reviews Neuroscience. 2000; 1, 67–73.
  5. L Ottoboni, B von Wunster, G Martino: Therapeutic Plasticity of Neural Stem Cells. Front. Neurol. 2020; 11, 148.