„Chemometec hat ein bildgebendes Zytometer, den NucleoCounter® NC-3000™ entwickelt, um verschiedene Marker während der Apoptose zu quantifizieren. Im Vergleich zum BD LSRII zeigt der NC-3000™ eine ebenso akkurate und präzise Detektion der Translokalisation von Phosphatidylserin, Aktivierung der Caspase 3/7 und Depolarisation der mitochondriellen Membran.“

Zellkultur

Verwendet wurden die Zelllinien U2OS (human osteosarcoma cell line, ECACC #92022711), CHO (Chinese hamster ovary cell line, ECACC #85050302) und Jurkat (human leukemia T cell line, ATCC #CRL-2570). Suspensionszellen (Jurkat) wurden bis zu einer Zelldichte von 5×10⁵ Zellen/ml in RPMI + 6 % FCS kultiviert. Die Zellsuspension wurde in 6 T-Flaschen halbiert und mit oder ohne 10 µM Camptothecin (CPT) inkubiert. Nach 16h wurden die Zellen geerntet und nach u.s. Protokoll gefärbt. Die Proben wurden jeweils in Duplikaten analysiert. Adhärente Zelllinien (U2OS und CHO) wurden bis zu einer Konfluenz von 90 % in RPMI + 6 % FCS kultiviert. Die Zellen wurden mit Trypsin abgelöst und in 6 T-Flaschen aufgeteilt. Die T-Flaschen wurden ca. 24h bis zu einer Konfluenz von 75 % kultiviert und jeweils die Hälfte der Flaschen (3 für jede Zelllinie) wurden mit 10 µM CPT behandelt. Nach weiteren 16h wurden die Zellen geerntet und nach u.s. Protokoll in Duplikaten analysiert.

Zellfärbung

Die Zellen wurden jeweils mit dem FITC Annexin V Kit (Biotium, #20991), FAM-FLICA^TM Caspases 3/7 Assay Kit (Immunochemistry, #94) und den Reagenzien 7/8 (Chemometec; JC-1 und DAPI, #910-3007, #919-3008) angefärbt.

Verwendete Geräte

Parallele Analysen wurden an denselben Zellproben durchflusszytometrisch (BD LSRII, BD Biosciences, 405, 488 und 635 nm Laser) sowie bildgebend (NucleoCounter^® NC-3000™, Chemometec) für jeweils 10.000 Zellen durchgeführt. Am BD LSRII wurden die Analysen für den Annexin V und Caspase Assay mit FITC und PE-Texas Red, sowie für das mitochondrielle Potential mit FITC und PE durchgeführt. Die Analysen am NC-3000™ wurden mit den vordefinierten Assays Annexin V Assay, Caspase Assay und Mitochondrial Potential Assay durchgeführt.

Datenanalyse

Um den direkten Vergleich zwischen beiden Geräten zu erleichtern, wurden die jeweiligen Daten in FCS Format exportiert und mit FlowJo (Version 7.6.5, Treestar) analysiert. Jeder Datenpunkt in den ausgewerteten Plots repräsentiert den Mittelwert von 6 Zellproben (3 unabhängige Zellproben in Duplikaten).

 

Abbildung 1: Repräsentatives Beispiel von Punktediagrammen für das BD LSRII und den NC-3000™. Jurkat Zellen wurden mit oder ohne 10 µM Camptothecin (CPT) für 16h inkubiert. Die Zellen wurden mit JC-1 angefärbt und mit dem BD LSRII und dem NC-3000™ analysiert. Die Daten wurden in FlowJo exportiert und dort ausgewertet. Die polarisierten und depolarisierten Zellpopulationen waren nahezu identisch zwischen dem BD LSRII und dem NC-3000™.

 

 

Abbildung 2: Quantifizierung des mitochondriellen Potentials mit dem BD LSRII und dem NC-3000™. Exponentiell kultivierte Zellen (untreated) und Zellen, behandelt mit Camptothecin (CPT treated) wurden mit JC-1 angefärbt und mit dem BD LSRII (rote Balken) und dem NC-3000™ (blaue Balken) analysiert. Die Balken zeigen den jeweiligen Anteil der Population mit einer polarisierten bzw. depolarisierten Membran. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert von 6 Zellproben (3 unabhängige Zellproben in Duplikaten). Der Fehlerbalken entspricht der Standardabweichung.

 

 

Abbildung 3: Quantifizierung der Caspase-Aktivität mit dem BD LSRII und dem NC-3000™. Exponentiell gewachsene Zellen (untreated) und mit Camptothecin behandelte Zellen (CPT treated) wurden mit FAM-DEVDFMK, Hoechst 33342 und Propidiumiodid (PI) angefärbt. Der Anteil an Caspase+ und PI+ Zellen wurde mit dem BD LSRII (obere Reihe) und dem NC-3000™ (untere Reihe) analysiert. Jeder Teil repräsentiert den Mittelwert von 6 Zellproben (3 unabhängige Zellproben in Duplikaten).

 

Abbildung 4: Vergleich der Translokalisation von Phosphatidylserin mit dem BD LSRII und dem NC-3000™. Exponentiell gewachsene Zellen (untreated) und mit Camptothecin behandelte Zellen (CPT treated) wurden mit FITC Annexin V, Hoechst 33342 und Propidiumiodid (PI) angefärbt. (A) Mit dem BD LSRII (obere Reihe) und dem NC-3000™ (untere Reihe) wurde der Anteil an Annexin V+ und PI+ Zellen ermittelt. Jeder Teil repräsentiert den Mittelwert von 6 Zellproben (3 unabhängige Zellproben in Duplikaten). (B) Fluoreszenzbild von CHO Zellen, behandelt mit CPT, erstellt durch Überlagerung der einzelnen Kanäle Hoechst 33342 (blau), FITC Annexin V (grün) und PI (rot) im NC-3000™. Vergrößerung 2x. Die 4 verschiedenen Populationen wurden durch Pfeile hervorgehoben.

Die Erfassung von großen Zellpopulationen wird heutzutage standardmäßig mit einem Durchflusszytometer durchgeführt. In dieser Studie wurde das bildgebende Zytometer NC-3000™ mit einem Durchflusszytometer, dem BD LSRII verglichen. Hierbei wurde die Translokalisation von Phosphatidylserin, das mitochondrielle Potential und die Aktivierung der Caspase 3/7 analysiert. Der NC-3000™ erzielte in allen drei Assays absolute vergleichbare Werte mit dem BD LSRII. Die Messungen ließen sich an beiden Geräten gleich präzise und reproduzierbar durchführen. Zusammengefasst zeigt dies, das der NC-3000™ eine neue Methode für die akkurate Quantifizierung von apoptotischen Zellpopulationen darstellt. Im Vergleich zu einem herkömmlichen Durchflusszytometer können die einzelnen Zellen mit dem NC-3000™ visuell dargestellt und die Färbung verifiziert werden.