Bestimmung der Zellzahl in einer Microcarrier Zellsuspension mit dem NucleoCounter®
Mit dem NucleoCounter® können Zellen in einer Microcarrier Zellsuspension zuverlässig und präzise ausgezählt werden. Durch die Zugabe zweier Reagenzien werden die Zellen von den Microcarriern effektiv abgelöst, lysiert und anschließend in eine Via1-Kassette™ geladen. Die Via1-Kassette™ wird in den NucleoCounter® eingesetzt, hier erfolgt die fluoreszente Anfärbung der Zellkerne sowie die automatische Bestimmung der Zellzahl und der Viabilität. Die gesamte Zellzählung kann ohne Pipettieren durchgeführt werden und dauert weniger als 5 min.


NC-200™ - Viability and Cell Count of Microcarrier Cultured Cells
NC-3000™ - Viability and Cell Count of Microcarrier Cultured Cells
Microcarrier zur Kultivierung von adhärenten Zellen
Für die Herstellung von Impfstoffen, Medikamenten und zellulären Produkten für die Anwendung in der Zelltherapie ist ein großer Produktionsmaßstab unerlässlich. Die Erhöhung der Virus- und Zellproduktion zur Prozessoptimierung kann sich jedoch als problematisch erweisen, da adhärente Zellen oftmals in Zellkulturflaschen expandiert werden. Eine platzsparende und geeignete Alternative hierzu stellt die Verwendung von Microcarriern dar. Microcarrier dienen als Substrat für die Adhäsion von adhärenten Zellen und erlauben die Zellexpansion in großem Maßstab in einem Bioreaktor, wobei die einzelnen Microcarrier Zellkomplexe in einer Nährlösung als Suspension vorliegen. Dieser Ansatz optimiert und vereinfacht den Produktionsprozess entscheidend.
Das Zählen von Zellkernen
Die Zellkerne werden mit dem selektiven DNA-Fluoreszenzfarbstoff DAPI spezifisch angefärbt, wobei eine präzise Detektion von Zellen und auch die Unterscheidung zu Zelltrümmern möglich ist. Die einzigartige Via1-Kassette™ kombiniert den mehrstufigen Ablauf bei der Zellzählung in einem einzigen Schritt. Hierzu wird die Via1-Kassette™ in den NucleoCounter NC-200™ oder NC-3000™ eingebracht und die Zellzahl sowie die Viabilität automatisch bestimmt.
Zeitsparende Zählung einer Microcarrier Zellsuspension
Die Zellzahl und die Viabilität sind entscheidende Parameter bei der großflächigen Überwachung einer Bioproduktion. Üblicherweise beinhaltet die Zählung einer Microcarrier Zellsuspension mehrere aufwendige Schritte. Zunächst werden die Zellen durch Trypsin enzymatisch von den Microcarriern abgelöst und anschließend mit Trypanblau angefärbt, wobei diese Methode zeitaufwändig und ungenau ist.
Ein Vergleich der Zählung einer Microcarrier Zellsuspension mit Trypsin und Trypanblau sowie mit dem NucleoCounter® macht den Unterschied deutlich: Im Vergleich zur herkömmlichen Zellzählung eliminiert der NucleoCounter® etliche Zentrifugations-, Inkubations- und Pipettierschritte und vermindert die benötigte Zeit auf weniger als 5 min.


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Literatur
In folgenden Publikationen wurde zur Bestimmung der Zellzahl in einer Microcarrier Zellsuspension der NucleoCounter™ verwendet:- Lam AT, Chen AK, Li J, et al., (2014), Conjoint propagation and differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes in a definedmicrocarrier spinner culture., Stem Cell Res Ther, Sep 15;5(5):11010.1186/scrt498
- Lam AT, Li J, Chen AK, et al., (2014), Cationic surface charge combined with either vitronectin or laminin dictates the evolution of human embryonicstem cells/microcarrier aggregates and cell growth in agitated cultures., Cell Therapy, Jul 15;23(14):1688-703, 10.1089/scd.2013.0645
- Heathman TR, Stolzing A, Fabian C, et al., (2016), Scalability and process transfer of mesenchymal stromal cell production from monolayer to microcarrierculture using human platelet lysate, Cancer Research, Apr;18(4):523-3510.1016/j.jcyt.2016.01.007
- Heathman TR, Glyn VA, Picken A, et al., (2015), Expansion, harvest and cryopreservation of human mesenchymal stem cells in a serum-free microcarrierprocess., Biotechnol Bioeng, Aug;112(8):1696-70710.1002/bit.25582
- Lam AT, Li J, Chen AK, et al., (2015), Improved Human Pluripotent Stem Cell Attachment and Spreading on Xeno-Free Laminin-521-CoatedMicrocarriers Results in Efficient Growth in Agitated Cultures, Biores Open Access, Apr 1;4(1):242-5710.1089/biores.2015.0010
- Chen AK, Chen X, Choo AB, et al., (2010), Expansion of human embryonic stem cells on cellulose microcarriers., Curr Protoc Stem Cell Biol., Sep;Chapter 1:Unit 1C.1110.1002/9780470151808.sc01c11s14
- Marinho PA, Vareschini DT, Gomes IC, et al., (2013), Xeno-free production of human embryonic stem cells in stirred microcarrier systems using a novelanimal/human-component-free medium., Tissue Eng Part C Methods., Feb;19(2):146-55.10.1089/ten.TEC.2012.0141
- Lecina M, Ting S, Choo A, et al., (2010), Scalable platform for human embryonic stem cell differentiation to cardiomyocytes in suspended microcarriercultures., Stem Cell Res Ther, Dec;16(6):1609-19.10.1089/ten.TEC.2010.0104
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