Aufdeckung der präzision ihrer manuellen zellzählungen

Haben Sie jemals Ihre Zellzählung wiederholt, nur um beim zweiten Mal ein ganz anderes Ergebnis zu erhalten? Wenn dies geschieht, können Sie wie gelähmt sein, Ihre Daten in Frage stellen und nicht in der Lage sein, Entscheidungen über Ihre Zellkultur oder zukünftige Experimente zu treffen.

In allen Bereichen der Wissenschaft kann die „Präzision“ (oder Wiederholbarkeit) über Erfolg oder Misserfolg von Experimenten entscheiden. Leider ist die manuelle Zellzählung besonders anfällig für Zufallsfehler und leidet daher oft unter einer geringen Präzision. Aber wenn Sie die Genauigkeit Ihrer Ergebnisse in Frage stellen, brauchen Sie nicht in Panik zu geraten. Es gibt viele Möglichkeiten, die Wiederholbarkeit Ihrer Zellzählungen zu verbessern.

In diesem Blogbeitrag behandeln wir:

 

Dartscheibe mit Shorts, die sowohl genau als auch präzise sind (links), nur präzise (Mitte) und weder präzise noch genau (rechts).

Wie messen wir die genauigkeit bei der zellzählung?

Wenn Sie sich nicht sicher sind, ob Ihre Zellzahlen den Anforderungen entsprechen, können Sie deren Präzision überprüfen, indem Sie Ihre Messungen wiederholen und die Standardabweichung (σ) und den Variationskoeffizienten (CV) Ihrer Ergebnisse berechnen.

Sie können Ihre Standardabweichung, die die Streuung Ihrer Ergebnisse um den Mittelwert anzeigt, mithilfe der folgenden Formel berechnen: 1

Formel für die Standardabweichung

HINWEIS: x = die individuelle Gesamtzellzahl, x̅ = der Mittelwert aller Werte, n = die Größe der Population.

Eine geringe Standardabweichung zeigt an, dass Ihre Zellzahlen nicht stark vom Mittelwert abweichen, d.h. Sie haben wiederholt konsistente Zellzahlen, was auf eine hohe Präzision hindeutet.

Sobald Sie die Standardabweichung Ihrer Ergebnisse ermittelt haben, können Sie auch den CV berechnen. Dies ist der gebräuchlichste Parameter zur Angabe der Genauigkeit von Zellzählungen und wird in der Regel als Prozentsatz ausgedrückt. Sie können den CV mit der folgenden Formel berechnen:

CV%-Formel

Erfahrene manuelle Zellzähler streben in der Regel einen CV von 5 – 15 % an. Wenn Ihr CV viel höher ist, möchten Sie vielleicht untersuchen, wie Sie Ihre Zellzählverfahren verbessern und Ihre Genauigkeit erhöhen können.

Eine schritt-für-schritt-anleitung zur validierung ihrer zellzahl

Wenn Sie immer noch Zweifel an Ihren Zellzahlen haben oder in einer GMP-Umgebung (Good Manufacturing Practice) arbeiten, müssen Sie Ihre Verfahren validieren. Die Validierung zeigt die Genauigkeit, Präzision und Robustheit Ihrer Prozesse und beweist, dass Ihre Methodik den Zweck erfüllt. Dazu gehört in der Regel die Durchführung einer Reihe von Experimenten, einschließlich Linearitätsstudien, um Ihre Präzision über eine Reihe von Konzentrationen hinweg zu untersuchen.

Wenn Sie mehr über die Validierung Ihrer Zellzählmethoden erfahren möchten, sehen Sie sich unser Webinar „Wie genau sind Ihre Zellzählungen?“ an: Ein Leitfaden zur Validierung einer Zellzählmethode.

Was sind die hauptfehlerquellen bei der manuellen zellzählung?

Die manuelle Zellzählung mit einem Hämozytometer ist oft fehleranfällig. Typische Fehler können bis zu 20 – 30 % betragen,2 und die geringe Präzision ist einer der größten Nachteile der Verwendung eines Hämozytometers. Die Identifizierung von Fehlern, die sich auf Ihre Ergebnisse auswirken, ist der erste Schritt zur Erhöhung Ihrer Präzision und zur Reduzierung Ihres Variationskoeffizienten.

Im Folgenden skizzieren wir vier Hauptfaktoren, die die Genauigkeit der Zellzählung beeinflussen:

1. Menschliches versagen während der probenvorbereitung

Wie alle Verfahren, die auf manueller Vorbereitung beruhen, ist die Zellzählung mit einem Hämozytometer anfällig für menschliche Fehler aus verschiedenen Quellen, darunter ungenaues Pipettieren, Verdünnungsfehler und schlechtes Mischen.3

Fehler können auch durch Überfluten der Hämozytometerkammern entstehen. Obwohl das Hämozytometer ein festes Volumen hat, kann sich der Raum zwischen der Zählkammer und dem Deckglas leicht vergrößern, wenn Sie die Kammer mit Flüssigkeit überfüllen. Eine Überladung der Zählkammer führt zu einer Unterschätzung des Probenvolumens und einer Überschätzung Ihrer Zellkonzentration.

Abbildung zeigt die Komponenten eines Hämozytometers und die Struktur des Gitters einer Neubauer-Kammer.

2. Subjektivität im zählprozess

Die Unterscheidung zwischen Zellen und Trümmern oder anderen Partikeln kann selbst für das geschulte Auge schwierig sein. Wenn Sie nicht einfach zwischen Zellen und Ablagerungen unterscheiden können, ist Ihre Zellzahl möglicherweise künstlich hoch.

Es kann auch schwierig sein festzustellen, ob sich eine Zelle innerhalb oder außerhalb eines Zählgitters befindet. Infolgedessen kann die manuelle Zellzählung subjektiv sein und die endgültige Zählung kann vom Bediener abhängen. Eine aktuelle Veröffentlichung von Manzini et al. zeigten, dass selbst bei sehr erfahrenen Bedienern in der Zellzählung die Abweichung zwischen den Bedienern fast 20 % erreichen kann. 4

3. Inkonsistenzen bei der zellfärbung

Trypanblau ist einer der am häufigsten verwendeten Farbstoffe bei der manuellen Zellzählung. Es ist ein membranundurchlässiger Farbstoff, der nur nicht lebensfähige Zellen mit beschädigten Zellmembranen anfärbt. Trypanblau färbt die Zellen jedoch nicht gleichmäßig. Dies führt zu Inkonsistenzen bei den Zellzahlen, da es schwierig sein kann, leicht gefärbte nicht lebensfähige Zellen von lebensfähigen zu unterscheiden.

Trypanblau ist auch zelltoxisch, daher kann die Anzahl toter Zellen höher sein, wenn Sie zwischen dem Färben und Zählen mehr Zeit lassen. Da Trypanblau ein Salz ist, kann es außerdem Veränderungen in der zellulären Osmoregulation hervorrufen, die Zellen zum Platzen bringen können, was die Gesamtzahl der toten Zellen künstlich verringert und zu einer Überschätzung der Lebensfähigkeit der Zellkultur führt.

In diesem Webinar erfahren Sie mehr darüber, wie Trypanblau Zellen beeinflussen kann.

4. Rechenfehler

Die manuelle Zellzählung beruht auf mehreren Berechnungen, einschließlich Verdünnungsfaktor, Gesamtzellzahl oder -konzentration, Lebensfähigkeit, Standardabweichung und CV. Wie bei allen Berechnungen können sich auch beim Notieren von Daten oder bei der Durchführung von Berechnungen menschliche Fehler einschleichen. Erhebliche Fehler sind in der Regel leicht zu erkennen, aber kleinere Fehler (ist die letzte Ziffer eine 1 oder eine 7?) können unbemerkt bleiben und die Genauigkeit Ihrer Endergebnisse beeinträchtigen.

So erhöhen sie die präzision bei der zellzählung

Sobald Sie wissen, woher Ihre Fehler kommen, können Sie damit beginnen, sie zu reduzieren oder zu eliminieren, um Ihre Gesamtpräzision zu erhöhen.

Sorgfältiges und konsequentes Arbeiten kann die Auswirkungen menschlicher Fehler reduzieren. Achten Sie beim Befüllen des Hämozytometers besonders darauf, dass Sie die Kammer nicht überfüllen.

Der Einfluss der Subjektivität auf den Zählprozess kann reduziert werden, indem Sie die Anzahl der Kammern erhöhen, die Sie zählen, und doppelte oder dreifache Zellzählungen durchführen, um Ihre Ergebnisse zu validieren. Wenn Sie sich entschließen, die Messungen zu wiederholen, stellen Sie sicher, dass Sie ein neues Aliquot an Zellen entnehmen, diese mit dem von Ihnen gewählten Farbstoff mischen und die Kammer neu beladen, anstatt nur die Zellen erneut zu zählen oder die Kammer mit einer zweiten Probe zu beladen, die bereits gefärbt ist. So erhalten Sie die repräsentativste Wiederholungsmessung.

Je mehr Zellen Sie zählen, desto geringer sind die Auswirkungen von Zufallsfehlern und desto präziser werden Ihre Ergebnisse sein. In der Regel sollten Sie mindestens 400 Zellen pro Probe zählen (weitere Informationen finden Sie in unserem technischen Hinweis „Auswirkungen der Probenkonzentration auf die Variation der Zellzählung“).

Sie können die Unterschiede zwischen den Benutzern verringern, indem Sie sich auf Regeln für die Zellzählung einigen und diese konsequent anwenden. Weitere Informationen zu den Regeln und Verfahren zur Zellzählung finden Sie unter „Geheimnisse preisgeben“: Wie man Zellen mit einem Hämozytometer zählt.

Sie können die Wahrscheinlichkeit von Berechnungsfehlern verringern, indem Sie Ihre Berechnungen automatisieren. Sie könnten zum Beispiel unsere herunterladbare Tabelle zur Zellzählung verwenden, die Ihren Verdünnungsfaktor, die Gesamtzellzahl, die Lebensfähigkeit, die Standardabweichung und den CV berechnet. Mit diesem Blatt können Sie Rechenfehler vermeiden und müssen sich keine Gedanken mehr darüber machen, ob Sie die Taste „5“ oder „6“ auf Ihrem Taschenrechner drücken.

Herunterladen des Zellzählungstools von ChemoMetec.

ChemoMetec-Tool zur Zellzählung

Umstellung auf automatische zellzählung

Wenn Sie Probleme mit der Genauigkeit Ihrer Zellzählungen haben, sollten Sie einen automatischen Zellzähler verwenden. Automatisierte Prozesse eliminieren Fehler, indem Zählprotokolle jedes Mal konsistent angewendet werden. Darüber hinaus zählen sie schnell eine große Anzahl von Zellen, wodurch die Auswirkungen zufälliger Fehler minimiert werden. Einige automatisierte Zähler verwenden auch fluoreszierende Farbstoffe anstelle von Trypanblau, wodurch die Probleme im Zusammenhang mit ungleichmäßiger Färbung und Toxizität beseitigt werden.

Die folgenden Diagramme zeigen die Genauigkeit der manuellen Zählung im Vergleich zur automatischen Zählung bei verschiedenen Zellkonzentrationen. Die Diagramme A und B zeigen den CV als Funktion der Zellkonzentration für A) automatisches Zellzählen unter Verwendung des NucleoCounter® NC-202™ und B) manuelles Zellzählen unter Verwendung eines Hämozytometers. 5

In Diagramm A liegen die meisten Datenpunkte entweder auf oder nahe der angepassten Kurve (dem Mittelwert), was auf eine geringe Varianz und eine hohe Präzision hinweist. In Diagramm B sind die Datenpunkte verstreut und nur wenige befinden sich auf der angepassten Kurve, was auf eine geringe Genauigkeit hinweist. Obwohl sowohl die automatisierte als auch die manuelle Zellzählung bei niedrigeren Zellkonzentrationen einen Anstieg des CV aufgrund erhöhter Beiträge von Zufallsfehlern aufweist, ist der Anstieg geringer, wenn die Zellen mit einem automatischen Zähler gezählt werden.

Punktdiagramm, das den CV% zeigt, wenn Zellen mit dem NucleoCounter® NC-202™ gezählt werden
Punktdiagramm, das den CV% zeigt, wenn die Zellen manuell gezählt werden
Der Vergleich der beiden Diagramme macht deutlich, dass die automatische Zellzählung eine bessere Präzision bietet als die manuelle Zählung. Tatsächlich kann die Verwendung eines automatischen Zellzählers die Genauigkeit Ihrer Zellzählung im Vergleich zur Verwendung eines Hämozytometers und der manuellen Zellzählung verdoppeln.5

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Verweise

  1. Ross, S. M. (2014). Introduction to Probability and Statistics for Engineers and Scientists (Fifth Edition), Chapter 2. Academic Press.
  2. Electron Microscopy Sciences: Neubauer Haemocytometry.
  3. Biggs, R. et al. (1948). The Errors of Some Haematological Methods as They Are Used in a Routine Laboratory. Journal of Clinical Pathology, 1(5):269-287.
  4. Manzini, P. et al. (2022). Validation of an automated cell counting method for cGMP manufacturing of human induced pluripotent stem cells. Biotechnology Reports, 33:e00708.
  5. ChemoMetec: Tech Note: NucleoCounter® NC-202™ Performance Data.
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