Zellbiologische Forschung

Abbildung 1. Die Via1-Cassette™ mit den lyophilisierten Fluorophoren Acridinorange und DAPI. Die Volumen-kalibrierte Via1-Cassette^TM für den einmaligen Gebrauch wird für die optimierte Zellzahlbestimmung verwendet. Die Kassette besteht aus Plastik und enthält bereits die für die Zellanalyse benötigten Fluorophore. Die Zellprobe wird durch das einfache Betätigen der eingebauten Pipette geladen.

Die manuelle Zellzählung basierend auf Hämozytometer und Trypanblau ist äußerst zeitaufwendig und die Messergebnisse sehr subjektiv, da es große Schwankungen zwischen unterschiedlichen Nutzern gibt. Für die automatisierte Bestimmung der Viabilität und Zellzahl mit dem NucleoCounter^® NC-200™ und NC-3000™ muss nur die Via1-Cassette™ (Abbildung 1) in die Zellsuspension inseriert und geladen werden. Die Zellen werden automatisch mit den zwei Fluorophoren Acridinorange und DAPI angefärbt, wobei Acridinorange alle Zellen anfärbt, der nukleäre Farbstoff DAPI färbt zusätzlich nur die toten Zellen an. Die Volumen-kalibrierte Messkammer der Via1-Cassette gewährleistet eine hohe Präzision und Reproduzierbarkeit. Die bildgebende Zytometrie mit den NucleoCounter^® Geräte erlauben eine detaillierte Analyse und Erfassung der Messergebnisse.

Abbildung 2. Durch die A8-Slides™ kann die Viabilität und Zellzahl von gleichzeitig bis zu 8 Proben in weniger als 3 Minuten bestimmt werden. Die Zellsuspension wird vor dem Laden mit den Fluorophoren Acridinorange und DAPI vermischt, um die Gesamtzellpopulation und die toten Zellen anzufärben.

Die A8-Slides™ (Abbildung 2) erlauben die schnelle Bestimmung der Zellzahl und Viabilität von Insektenzellen und Säugetierzellen mit bis zu 8 Messungen gleichzeitig. Die Zellsuspension wird mit den Fluorophoren Acridinorange und DAPI gemischt, um die gesamte Zellpopulation und die toten Zellen anzufärben. Anschließend wird die Kammer mit der Zellsuspension geladen und der A8-Slide™ in den NucleoCounter^® NC-250™ und NC-3000™ inseriert. Das Unternehmen ChemoMetec A/S bietet weiterhin spezialisierte Zellzählprotokolle für aggregierte Zellen, Zellen in einer Microcarrier Zellsuspension und Zellen in Sphäroiden an.

Abbildung 3. Visuelle Inspektion der gezählten Zellen mit Hilfe der Nuceloview™ Software. Um die Zellzählung zu verifizieren, können die Zellen von dem Punktediagramm zum Fluoreszenzbild und vom Fluoreszenzbild zum Punktediagramm nachverfolgt und spezifisch lokalisiert werden.

Während der manuellen Zellzählung wird die Zählung visuell identifiziert und verifiziert. Die NucleoView™ Software erlaubt auch die Verifizierung der Messergebnisse, indem spezifisch Zellpopulationen im Punktediagramm ausgewählt, und im Fluoreszenzbild evaluiert werden können, um zu entscheiden, ob sie in das Endergebnis mit einberechnet werden sollen (Abbildung 3). Das adaptierte Protokoll kann für spätere Messungen abgespeichert werden.

Für die erweiterte Analyse der Vitalität von Zellen ist es wichtig, den Apoptose-Mechanismus zu verstehen. Mit dem NucleoCounter^® NC-3000™ können verschiedene einfache Assays durchgeführt werden, darunter der Annexin V Assay, der Assay zur Analyse des mitochondriellen Potentials mit dem Farbstoff JC-1, die Assays zur Analyse des Caspase-Signalweges, der Assay zur Bestimmung der DNA-Fragmentation und der einzigartige einminütige Vitalitäts-Assay (Tabelle 1). Diese Assays eigenen sich zur Bestimmung der frühen bis späten Apoptose von Säugetierzellen. Mit den anwenderfreundlichen Protokollen und der begleitenden Nuceloview^TM Software kann eine erweiterte Analyse der Daten durchgeführt werden. Durch die einzigartige bildgebende Analyse sind die Fluoreszenzbilder, sowie die Histogramme und die Punktediagramme miteinander verbunden und lassen eine präzise Verifizierung der apoptotischen, nekrotischen und lebendigen Zellen zu.

Tabelle 1. Bestimmung von Apoptose und Nekrose. Verschiedene einfache Assays erlauben die detaillierte Zellanalyse mit dem NucleoCounter^® NC-3000™.

Oftmals werden Zellen mit bestimmten Genen transfiziert. Um die Konsistenz der Expression Gene zu Überwachen, können auch fluoreszente Proteine unter demselben Promotor ko-exprimiert und quantitativ bestimmt werden, z.B. das green fluorescent protein (GFP). Das Unternehmen ChemoMetec A/S bietet einen einfachen und schnellen Assay für die Bestimmung der GFP-Transfektionseffizienz mit dem NucleoCounter^® NC-3000™ an (Abbildung 4). Die Zellen werden mit Hoechst 33342 und Propidiumiodid (PI) angefärbt, um die Gesamtzellpopulation und die tote Zellpopulation zusammen mit der GFP-exprimierenden Population zu bestimmen. Dabei können die Messergebnisse zwischen dem Fluoreszenzbild und dem Punktediagramm oder den Histogrammen verifiziert werden (Abbildung 5). Der NucleoCounter^® NC-3000™ bietet sich als Komplettlösung für die Evaluation der GFP-Expression an.

Abbildung 4. Das Prinzip des Assay zur Bestimmung der GFP-Transfektionseffizienz mit dem NucleoCounter^® NC-3000™. (A) Die Zellen werden durch die Anfärbung mit Hoechst 33342 (blau) lokalisiert und die Anzahl an GFP-exprimierenden Zellen (grün) kann einfach bestimmt werden. Die toten Zellen werden durch Propidiumiodid (PI; rot) angefärbt. (B) Die NucleoView™ Software erlaubt die Identifizierung aller Zellen durch Hoechst 33342 (blau). (C) Zellen, die GFP exprimieren, werden in grün dargestellt. Tote Zellen sind positiv für die Färbung mit PI (rot).

Abbildung 5. Die Verifizierung der Messergebnisse durch den Link zwischen dem Punktediagramm und Fluoreszenzbild über definierte Gates. (A) In der NucleoView™ Software können die toten Zellen, angefärbt mit Propidiumiodid (PI) lokalisiert werden. (B) Ebenso erlaubt die NucleoView™ Software die genaue Identifizierung der GFP-exprimierenden Zellen.

Abbildung 6. Schnelle Zellzyklusanalyse. (A) Die unterschiedlichen Zellzyklus-Phasen können über die Anzahl an DNA-Kopien durch einen fluoreszenten DNA-Farbstoff unterschieden werden. (B) Jurkat Zellen wurden mit und ohne Camptothecin (CPT) behandelt, anschließend wurde eine Zellzyklus-Analyse durchgeführt. In den Histogrammen können über die Intensität des DNA-Fluorophors DAPI die einzelnen Phasen Sub-G1, G0/G1, S und G2/M identifiziert werden. Nach der Behandlung mit CPT tritt in der G2/M-Phase ein Zellzyklus-Arrest ein.

Die Zellzyklusanalyse stellt eines der wichtigsten Werkzeuge bei der Erforschung neuer Medikamente im Bereich der Zellbiologie dar. Die NucleoCounter^® Geräte NC-250™ und NC-3000™ erlauben eine einfache und schnelle Zellzyklusanalyse in weniger als 5 Minuten (Abbildung 6). Durch die Zugabe eines Lysepuffers werden die Zellen lysiert und anschließend die Zellkerne angefärbt, sowie der Zellzyklus mit den NucleoCounter^® Geräten analysiert. In der zugehörigen NucleoView™ Software wird ein Zellzyklusprofil erstellt, wobei die einzelnen Phasen Sub-G1, G0/G1, S und G2/M dargestellt und identifiziert werden können. Mit der Option FlexiCyte™ im NucleoCounter^® NC-3000™ kann selbst die Inkorporation von BrdU und EdU für die Messung der Zellproliferation nachgewiesen werden.

Abbildung 7. Der Anwender kann unter verschiedenen LEDs und Emissionsfilter-Kombinationen im NucleoCounter^® NC-3000™ mit der Option FlexiCyte™ wählen. Hierdurch können verschiedene fluoreszente Antikörper und Proteine detektiert werden, wodurch eine detaillierte Analyse von Biomarkern möglich wird.

Die Option im NucleoCounter^® NC-3000™ ermöglicht es dem Anwender, erweiterte detaillierte Zellanalysen für ein breites Spektrum an Biomarkern und fluoreszenten Proteinen durchzuführen (Abbildung 7). Die Kombination aus verschiedenen LEDs vom UV-Bereich bis hin zum roten Spektrum und eine Auswahl an Emissionsfiltern erlaubt die Detektion einer großen Anzahl an fluoreszenten Antikörpern und Proteinen. Für die Erstellung eines solchen anwenderspezifischen Protokolls wird der ‘Protocol Adaptation Wizard’ verwendet, welcher den Anwender durch die verschiedenen Einstellungen führt. Im Anschluss an die Messung können die Daten neben dem Fluoreszenzbild auch als Punktediagramme und Histogramme im plot manager dargestellt werden. Eine detaillierte Datenanalyse und Verifizierung der Messungen kann durch die verlinkten Fluoreszenzbilder und Diagramme erfolgen.