Krebsforschung
Zellzahlbestimmungen, Zellzyklus und Apoptose
Einleitung
Abbildung 1. Schnelle Zellzyklusanalyse von Krebszellen. (A) Die unterschiedlichen Zellzyklus-Phasen können über die Anzahl an DNA-Kopien durch fluoreszente DNA-Farbstoffe unterschieden werden. (B) Jurkat Zellen wurden mit und ohne Camptothecin (CPT) behandelt, anschließend wurde eine Zellzyklus-Analyse durchgeführt. In den Histogrammen können über die Intensität des DNA-Fluorophors DAPI die einzelnen Phasen Sub-G1, G0/G1, S und G2/M identifiziert werden. Nach der Behandlung mit CPT tritt in der G2/M-Phase ein Zellzyklus-Arrest ein.
Im Vergleich zu gesunden Zellen teilen sich Krebszellen aufgrund verschiedener Mutationen bei der Regulation des Zellzykluses unkontrolliert und bilden Metastasen und Tumore. Deshalb stellt die Zellzyklusanalyse eines der wichtigsten Werkzeuge bei der Erforschung von Krebszellen dar. Die NucleoCounter® Geräte NC-250™ und NC-3000™ erlauben eine einfache und schnelle Zellzyklusanalyse in weniger als 5 Minuten (Abbildung 1). Durch die Zugabe eines Lysepuffers werden die Zellen lysiert und anschließend die Zellkerne angefärbt, sowie der Zellzyklus mit den NucleoCounter® Geräten analysiert. In der zugehörigen NucleoView™ Software wird ein Zellzyklusprofil erstellt, wobei die einzelnen Phasen Sub-G1, G0/G1, S und G2/M dargestellt und identifiziert werden können. Mit der Option FlexiCyte™ im NucleoCounter® NC-3000™ kann selbst die Inkorporation von BrdU und EdU für die Messung der Zellproliferation nachgewiesen werden.
WeiterlesenEin wichtiges Ziel bei der Erforschung von Krebserkrankungen ist die Zerstörung von Krebszellen, ohne dabei den gesunden Körperzellen zu schaden. Hierfür muss der Zelltod bei Krebszellen und auch bei gesunden Körperzellen detailliert analysiert werden. Wichtig dabei ist eine genaue Aussage darüber, ob es sich um Apoptose oder Nekrose handelt, ob die Zellen früh- oder spät-apoptotisch sind und ob es sich um den intrinsischen oder extrinsischen Weg der Apoptose handelt. Mit dem NucleoCounter® NC-3000™ können verschiedene einfache Assays durchgeführt werden, darunter der Annexin V Assay, der Assay zur Analyse des mitochondriellen Potentials mit dem Farbstoff JC-1, die Assays zur Analyse des Caspase-Signalweges, der Assay zur Bestimmung der DNA-Fragmentation und der einzigartige einminütige Vitalitäts-Assay (Tabelle 1).
| Plug-and-play Assays mit dem NucleoCounter® NC-3000™ | |
|---|---|
| Anwendung | Relevanz |
| Zellzählung | |
| Viability and Cell Count Assay | Präzise Bestimmung der Zellzahl und Viabilität von Zellen |
| Viability and Cell Count – Aggregated Cells Assay | Präzise Bestimmung der Zellzahl und Viabilität von aggregierten Zellen |
| Viability and Cell Count – A100 and B | Präzise Bestimmung der Zellzahl und Viabilität von stark aggregierten Zellen und einer Microcarrier Zellsuspension |
| Viability and Cell Count – Blood Assay | Präzise Bestimmung der Zellzahl und Viabilität von Zellproben, die Erythrozyten enthalten |
| Apoptose und Nekrose |
|
| Mitochondrial Potential Assay | Frühe Apoptose – detektiert Veränderungen im mitochondriellen Potential |
| Annexin V Assay | Frühe bis mittlere Apoptose – detektiert den Zusammenbruch der Phospholipid-Asymmetrie |
| Caspase Assay | Frühe bis mittlere Apoptose – detektiert Veränderungen in der Aktivität der Caspasen 3/7, 8 und 9 |
| Vitality (VB-48) Assay | Späte Apoptose – detektiert Veränderungen im Thiol-Status der Zellen |
| DNA Fragmentation Assay | Späte Apoptose – detektiert die DNA-Fragmentation (Sub-G1) |
| GFP | |
| GFP Transfection Assay – Hoechst and PI | Detektion der GFP-transfizierten und der toten Zellen in einem Durchlauf |
| Zellzyklus | |
| 2-step Cell Cycle Assays | Einzigartiger Zellzyklus-Assay in 5 Minuten |
| Fixed cell cycle assay | Herkömmlicher Zellzyklus-Assay an fixierten Zellen mit DAPI oder PI |
| FlexiCyte™ | |
| FlexiCyte™ | Anwenderspezifische LEDs, Emissionsfilter und Einstellungen |
Tabelle 1. Bestimmung von Apoptose und Nekrose in Krebszellen. Verschiedene einfache Assays erlauben die detaillierte Zellanalyse mit dem NucleoCounter® NC-3000™.
Abbildung 2. Zellzahlbestimmung in Sphäroiden. Durch die Verwendung eines Lysepuffer-Systems (Reagenz A100 und B) werden die Sphäroide aufgelöst und die Zellmembran permeabilisiert. Anschließend werden die Zellkerne mit DAPI angefärbt und die Zellzahl durch die NucleoCounter® Geräte akkurat bestimmt.Da herkömmliche, 2D Kulturbedingungen nicht ausreichend sind, komplexe und heterogene Strukturen von Tumoren in vivo darzustellen, wird nach Möglichkeiten gesucht, Krebszellen in 3D zu expandieren und zelltoxische Effekte beim Screening von Medikamenten in vitro zu analysieren. Verschiedene 3D Kulturen wurden für diesen Zweck entwickelt, darunter hanging drops und Pelletkulturen, wobei Sphäroide gebildet werden. Die Bestimmung der Zellzahl eines solchen Sphäroiden durch manuelle Zellzählung oder automatisierte Zellzählgeräte ist unmöglich, da die einzelnen Zellen eines Sphäroiden nicht voneinander unterschieden werden können. Die NucleoCounter® Geräte erlauben die schnelle und einfache Bestimmung der Zellzahl in Sphäroiden durch die Verwendung eines spezialisierten Assays (Abbildung 2). Durch die Verwendung eines Lysepuffers werden die Sphäroide aufgelöst und die Zellmembranen permeabilisiert, wodurch die Zellkerne mit DAPI angefärbt, und die Zellzahl mit den NucleoCounter® Geräten bestimmt werden kann.
Abbildung 3. Bei Microcarriern handelt es sich um ein Substrat für adhärente Zellen. Hierdurch können adhärente Zellen in einer Suspension und in einem Bioreaktor expandiert werden.
Werden Krebszellen in dreidimensionalen Sphäroiden kultiviert, kann die limitierende Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen die Zellexpansion hemmen. Neben der Kultivierung in Sphäroiden können Krebszellen in vitro auch auf Microcarriern oder in makroporösen Microcarriern expandiert werden, um den Einfluss der Zellmorphologie und der Zellkontakte auf medikamentöse Behandlung zu untersuchen. Die Bestimmung der Zellkonzentration und Viabilität einer Microcarrier Zellsuspension gestaltet sich dabei als äußerst schwierig und zeitaufwendig, da die Zellen zunächst enzymatisch von den Microcarriern abgelöst werden müssen. Die NucleoCounter® Geräte erlauben durch ein einzigartiges Protokoll die exakte Bestimmung der Zellzahl und Viabilität ohne enzymatische Vorbehandlung (Abbildung 3). Durch die Verwendung des, Viability and Cell Count – A100 and B Assay“ werden die Zellen von den Microcarriern abgelöst und lysiert. Anschließend werden die Zellkerne mit DAPI angefärbt, und die Gesamtzellzahl mit den NucleoCounter® Geräten bestimmt. In einem weiteren Schritt werden die toten Zellen ohne Zelladhäsion durch DAPI ohne Vorbehandlung der Zellsuspension angefärbt und gemessen.
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