Annexin V Assay
Detektion der Apoptose mit Annexin V und dem NC-3000™
Die Translokalisation von Phosphatidylserin auf die Außenseite der Zellmembran findet während der frühen Apoptose statt und kann mit Annexin V, gekoppelt an ein Fluorophor detektiert werden.
Das Wichtigste:
- Informationen über die Anzahl an früh-apoptotischen und spät-apoptotischen bzw. nekrotischen Zellen
- Schnelle automatisierte Einzelzellanalyse
- Standardisierte Ergebnisse – selbst mit verschiedenen Nutzern
- Nutzerfreundliches Protokoll mit vordefinierten Einstellungen
- Keine Kalibrierung notwendig
- Datenpräsentation über den Plotmanager
- Automatisierte PDF Reporte
- Export der der Daten in FCS/ ACS Format möglich
Application Note (.PDF):Überblick
Während der frühen Apoptose wird das Protein Phosphatidylserin von der Innenseite auf die Außenseite der Membran umgelagert. Durch diese Translokalisation kommt es im weiteren Verlauf zum Verlust der Membranintegrität und der DNA Fragmentation. Annexin V gehört zu einer Gruppe von zellulären Proteinen, welche kalziumabhängig an Phosphatidylserin binden. Da insbesondere das Annexin V eine sehr hohe Affinität zu Phosphatidylserin aufweist, wird es für die Detektion von apoptotischen Zellen verwendet.
An Annexin V kann ein Fluorophor gekoppelt und die Translokalisation der Membran detektiert werden. Da Annexin V auch an spät-apoptotische oder nekrotische Zellen binden kann, werden die Zellkerne dieser Zellen zusätzlich mit Propidiumiodid angefärbt. Somit können die einzelnen Stadien leicht voneinander unterschieden werden.
Das Prinzip
Zellen, gefärbt mit Hoechst 33342, Propidiumiodid und Annexin V – FITC werden durch die Verwendung der bildgebenden Analyse im NucleoCounter® NC-3000™ automatisch analysiert.
Durch Hoechst 33342 werden alle Zellen, durch Annexin V die apoptotischen und nekrotischen Zellen angefärbt. Früh-apoptotische Zellen können im Gegensatz zu spät-apoptotischen und nekrotischen Zellen nicht mit Propidiumiodid angefärbt werden. Somit können die einzelnen Stadien leicht voneinander unterschieden werden.
Die Ergebnisse im Plotmanager
Abbildung: Jurkat Zellen wurden mit (untere Reihe) oder ohne (obere Reihe) Camptothecin (CPT) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Hoechst 33342, Propidiumiodid und Annexin V – FITC angefärbt, sowie mit dem NucleoCounter® NC-3000™ analysiert. Die Punktediagramme und Histogramme wurden mit der NucleoView™ Software erstellt. Die Gates und Marker in den dargestellten Plots wurden verwendet, um die verschiedenen Zellpopulationen voneinander abzugrenzen. In diesem Beispiel zeigte die Behandlung mit CPT einen starken Anstieg in der Anzahl an früh-apoptotischen Zellen.
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