Alle ihre fragen zur zellzählung, beantwortet
… und vier wichtige zu berücksichtigende variablen
– 7 minutes
Kernpunkte:
- Die Quantifizierung von Zellen hilft Ihnen, ihre Lebensfähigkeit und ihr Wachstumsmuster zu bestimmen
- Manuelle Methoden drehen sich um die Verwendung von Hämozytometern, die durch Lichtmikroskopie beobachtet werden
- Automatisierte Instrumente basieren entweder auf elektrischer Impedanz, Durchflusszytometrie oder Bildzytometrie
- Zeitverbrauch, Genauigkeit und Konsistenz variieren zwischen diesen Ansätzen
Was ist zellzählung?
Eine einfache, aber wichtige Frage. Einige mögen sagen, dass die Zellzählung nur das Zählen von Zellen ist. Tatsächlich handelt es sich aber um so viel mehr als das. Zellzählung ist unter anderem…
- …routine. Sorgen Sie für Konsistenz bei Experimenten, an denen Zellen beteiligt sind, indem Sie sie überprüfen. Stellen Sie sicher, dass sie wie erwartet aussehen und sich so verhalten, damit Sie einen Schritt voraus sind.
- …aufschlussreich. Sie kann Ihnen Auskunft über die Lebensfähigkeit der Zellen sowie über die Standardabweichung und die Varianz geben, wenn Sie die Zellzählung mehrfach durchführen. Natürlich wirken sich auch andere Faktoren als nur der Zustand der Zellen auf diese Zahlen aus – dazu später mehr.
- … fürsorglich. Sich um Ihre Zellen und deren Gesundheit kümmern. Behalten Sie im Auge, wie es ihnen in ihrem Kulturmedium geht, und geben Sie ihnen die besten Bedingungen, um zu gedeihen.
- … in Vorbereitung. Planen und pflegen Sie eine Zellkultur, bis sie benötigt wird. Dies ist zum Beispiel in verschiedenen Assays oder der Proteinproduktion entscheidend, um die gewünschten Ergebnisse sicherzustellen.
Was sind die methoden?
Im Bereich der Zellzählung wird hauptsächlich zwischen manuellen und automatisierten Verfahren unterschieden. Beide Methoden zum Zählen von Zellen erfordern eine Zellfärbung vor der Zählung, um zwischen toten und viablen Zellen in einer Probe zu unterscheiden.
Insbesondere bei der manuellen Zellzählung wird Trypanblau häufig zum Färben toter Zellen verwendet, da es nicht membrandurchlässig ist1. Andere Farbstoffe umfassen Propidiumiodid (PI), Erythrosin B, Acridinorange (AO) und DAPI.
Beginnen wir mit der manuellen Methode.
Manuelle zellzählung
Es ist eine Methode, mit der die meisten von uns vertraut sind. Sie haben eine verdünnte Zellkultur (z.B. in PBS), die Sie färben. Anschließend können Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und einem Strichzähler 2 zählen. Eine ausführlichere Anleitung finden Sie in unserem Blog zu Hämozytometern.
Vorteile: Die meisten Geräte müssen nur einmal gekauft werden. Das einzige austauschbare Teil ist das Hämozytometer (das Sie waschen und wiederverwenden können), was es zu einer äußerst kostengünstigen Methode zum Zählen von Zellen macht.
Um eine der Hämozytometerkammern zu füllen, benötigen Sie nur 10 μl verdünnte Zellsuspension, sodass Sie auch bei geringem Volumen Ihrer Zellkultur eine Zählung durchführen können.
Nachteile: Die Methode ist anfällig für viel Subjektivität hinsichtlich der Definition einer Zelle, was die Genauigkeit der Gesamtzellzahl beeinträchtigen kann. Dieses Problem wird besonders deutlich, wenn mit aggregierten Zellen gearbeitet wird.
Außerdem benötigen Sie Erfahrung im Umgang mit einem Mikroskop, um Zellen zählen zu können. Das manuelle Zählen der Zellen dauert relativ lange, was auch zu höheren Arbeitskosten führt.
Vergessen wir nicht die automatisierten Methoden.
Automatisierte Zellzähler werden in drei Typen unterteilt. Es mag ein bisschen einschüchternd erscheinen, aber keine Angst – wir führen Sie durch sie.
Basierend auf der elektrischen impedanz
Auf elektrischer Impedanz basierende Zellenzähler werden auch als Coulter-Zähler bezeichnet. Diese basieren auf dem Coulter-Prinzip, das besagt, dass sich die Impedanz eines Teilchens in einem elektrischen Strom von der seines Puffers oder Mediums unterscheidet.
Die Zellen werden gezählt, indem sie durch eine Öffnung gepumpt und der Widerstand gemessen wird3.
Vorteile: Coulter-Zähler können viele verschiedene Arten von Partikeln zählen, einschließlich kernhaltiger und nicht kernhaltiger Zellen. Außerdem erhalten Sie eine genaue Anzahl von Zellen in jedem Volumen im Gegensatz zur manuellen Methode, bei der die Zellen/μl basierend auf der Zellzahl eines kleinen Bereichs geschätzt werden.
Nachteile: Mit dieser Methode können Sie im Gegensatz zu bildbasierten Methoden nicht zwischen viablen und nicht viablen Zellen unterscheiden. Weitere Einschränkungen sind, dass kleine Partikel unbemerkt bleiben können, Aggregate als eine Zelle gezählt werden und Ihre Wahl des Zellmediums auf Elektrolyte beschränkt ist.
Basierend auf optischer/durchflusszytometrie
Zellen können auch durch Durchflusszytometrie gezählt und charakterisiert werden. Hier wird ein Anregungslaser auf die vorbeischwimmenden Zellen gerichtet und das Streulicht durch verschiedene Filter und Detektoren geleitet. Diese Signale werden dann verstärkt und zur Analyse an ein Computersystem weitergeleitet3.
Vorteile: Es ist eine zeitsparende Methode, die im Vergleich zur manuellen Zellzählung eine schnelle und präzise Zellzählung ermöglicht. Mit dieser Methode können Sie die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmen, indem Sie die Zellen sowohl mit einem membrandurchlässigen als auch mit einem membranundurchlässigen Fluoreszenzfarbstoff färben. Die Anregungswellenlänge der lebensfähigen Zellen wird sich von den lebensfähigen Zellen unterscheiden und die Lebensfähigkeit der Zellen widerspiegeln.
Nachteile: Das wichtigste Instrument ist hier ein Durchflusszytometer, das im Vergleich zu bildbasierten Zellzählern (siehe Abschnitt unten) ein teures Instrument ist. Zu diesen Kosten kommt noch hinzu, dass Sie in der Verwendung eines Durchflusszytometers zur Zellzählung geschult werden müssen. Bei der Quantifizierung von Zellen, die zur Verklumpung neigen, können Schwierigkeiten auftreten.
Bildbasierte zytometrie
Die bildbasierte Zytometrie ist in hohem Maße von der Bildverarbeitung von Zellen abhängig, wobei maschinelles Lernen und fortschrittliche Algorithmen verwendet werden, die auf das spezifische Zellzählungsprotokoll zugeschnitten sind.
Diese Bilder werden entweder durch ein Hellfeld- oder ein Fluoreszenzmikroskopobjektiv3 aufgenommen.
Vorteile: Die computergestützte Zellerkennung dieser Methode ermöglicht die Quantifizierung von Aggregaten.
Es gewährleistet auch die Konsistenz des Zellzählungsprotokolls, da die Mikroskopie von einem Computer durchgeführt wird, um menschliche Voreingenommenheit auszuschließen.
Nachteile: Ein Bildzytometer ist im Vergleich zu einem Hämozytometer ein kostspieliges Instrument. Viele dieser Zellzähler erfordern auch spezielle Einweg-Objektträger oder Kassetten zum Laden der Probe.
Vier wichtige zu berücksichtigende variablen
Bevor Sie sich entweder zur manuellen oder automatisierten Zellzählung verpflichten, sollten Sie die folgenden Faktoren berücksichtigen:
#1 Der preis zählt!
Ein allgemeiner Standpunkt ist, dass die manuelle Zellzählung aufgrund der geringen Kosten des Hämozytometers im Gegensatz zu den Kosten automatisierter Instrumente erheblich billiger ist. Sie müssen jedoch berücksichtigen, dass dies zusätzliche Kosten für menschliche Arbeit mit sich bringt (was tatsächlich eine Menge ausmacht).
Es ist auch anfällig für viele Fehler2, und wie wir alle wissen, sind Fehler teuer. Bei Verwendung eines automatisierten Zählers entfallen diese Kosten.
#2 Consistency is key
Jeder Wissenschaftler weiß, dass seine experimentellen Ergebnisse nur dann gültig sind, wenn ein Forscher aus einem anderen Labor das gleiche Protokoll befolgen kann und die gleichen Ergebnisse erhält.
Diese Reproduzierbarkeit ist bei automatisierten Zellzählern durch den hohen Standardisierungsgrad gewährleistet, im Gegensatz zur manuellen Zellzählung, bei der andere Faktoren die Ergebnisse stören – mehr dazu in Abschnitt #3.
#3 Ist das menschliche auge genau genug?
Sicherlich haben Sie versucht, doppelte Zellzählungen durchzuführen, nur um festzustellen, dass die Zahlen variieren, obwohl Sie dieselbe Probe verwendet haben!
Dieses Problem tritt besonders beim manuellen Zählen von Zellen auf, teilweise aufgrund der menschlichen Voreingenommenheit (die entscheidet, was als Zelle definiert wird) und teilweise, weil ein Hämozytometer leicht überfüllt wird. Sie können diese Probleme mit automatisierten Zellzählern vermeiden, da menschliche Fehler eliminiert würden. Lerne mehr.
#4 Den prozess beschleunigen
Die automatisierte Zellzählung kann anfangs zeitaufwändig sein, weil sie eine Schulung erfordert, aber wenn Sie den Dreh raus haben, werden Sie schneller sein als mit der manuellen Methode.
Die manuelle Zellzählung ist zeitaufwändig, da die Zellen einzeln gezählt werden und Berechnungen wie die Gesamtzellzahl und die Viabilität anschließend manuell durchgeführt werden. Mit einer automatisierten Methode wird all diese Arbeit an den Zellzähler übergeben, wodurch Zeit für alle anderen spannenden Projekte in Ihrem Labor frei wird!
Branchen, die sich auf die zellzählung verlassen
Jetzt, da Sie (fast) alles über das Zählen von Zellen wissen, möchten wir Sie darüber informieren, wofür Sie dieses Wissen verwenden können.
- Zelltherapie: Die Zellzählung wird verwendet, um die richtigen Dosen für zellbasierte Therapeutika zu bestimmen, sowie um sicherzustellen, dass das Produkt standardisiert ist4.
- Bioverarbeitung: In diesem Bereich wird die Zellzählung zur routinemäßigen Überwachung des Zustands, d.h. des Wachstums und der Lebensfähigkeit der Zellkulturen in den Bioreaktoren eingesetzt. Dies ermöglicht eine Optimierung der Ausgabe basierend auf der Wachstumsphase der Zellkultur5.
- • Medikamentenentwicklung: Nachdem die Zellen mit potenziellen Arzneimittelkandidaten behandelt wurden, wird die Zellzählung verwendet, um die Lebensfähigkeit zu überwachen. Es ist auch entscheidend, die Reproduzierbarkeit sicherzustellen6.
Wie Sie sehen können, sind die Grenzen endlos. Ob manuell oder automatisiert, die Zellzählung hat viele Anwendungen, die Ihre Laborarbeit sicherlich ergänzen und Ihnen helfen werden, bessere Ergebnisse zu erzielen.
In diesem Sinne, worauf warten Sie noch? Probieren Sie einige dieser verschiedenen Methoden aus und finden Sie heraus, welche für Ihr Labor am besten geeignet ist. Viel Spaß beim Zählen!
Weiterführende literatur
- Blogbeitrag: Geheimnisse preisgeben: Wie man Zellen mit einem Hämozytometer zählt
- Mini Review: Manuelle versus Automatisierte Zellzählung
- Webinar: Are Sticky Cells Stickying up Your Data?
- Blogbeitrag: Ist Trypanblau toxisch? Die dunkle Seite des beliebten Farbstoffs
- Webinar: Wirkt sich PBS auf Ihre Zellen aus?
- Die NucleoCounter®-Reihe: Automatisierte Zellzähler und Analyseinstrumente
Verweise
- Johnson, S., Nguyen, V. and Coder, D. (2013), Assessment of Cell Viability. Current Protocols in Cytometry, 64: 9.2.1-9.2.26
- Electron Microscopy Sciences: Neubauer Haemocytometry
- Vembadi A, Menachery A, Qasaimeh MA. Cell Cytometry: Review and Perspective on Biotechnological Advances. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:147
- Sarkar S, Pierce L, Lin-Gibson S, Lund S (2019). Standards Landscape in Cell Counting: Implications for Cell & Gene Therapy. Cell and Gene Therapy Insights. 5. 117-131. 10.18609/cgti.2019.016.
- Butler M, Spearman M, Braasch K (2014). Monitoring Cell Growth, Viability, and Apoptosis. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 1104. 169-92. 10.1007/978-1-62703-733-4_12.
- Niepel M, Hafner M, Mills CE et al. A Multi-center Study on the Reproducibility of Drug-Response Assays in Mammalian Cell Lines. Cell Syst. 2019 Jul 24;9(1):35-48.e5
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