Zellzählung und Viabilität in Microcarrierkulturen

Das Hochskalieren der Kultur von Stammzellen, Viren oder anderen Zellen für die Arzneimittelproduktion und therapeutische Anwendungen kann eine Herausforderung sein. Microcarrier bieten eine komfortable Methode für die Kultur  von adhärenten Zellen in Bioreaktoren. Sie ermöglichen die Kultivierung einer großen Anzahl von Zellen in einem kleineren Volumen und tragen dazu bei, die Prozesskomplexität und Arbeitsintensität auch bei Großproduktionen zu reduzieren.

Microcarrier dienen als Gerüst, an das sich adhärente Zellen anlagern und sich so vermehren können, während ein Bioreaktor den Zell-Microcarrier-Komplex frei im Medium schweben lässt. Daher werden adhärente Zelllinien wie Suspensionszellen gezüchtet, was die Skalierung vereinfacht und es ermöglicht, vorhandene Ressourcen für die Prozessoptimierung und Produktion zu nutzen.

Typische Materialien für Mikroträger sind Acrylamid, Alginat, Dextran, Gelatine, Glas und Polystyrol, die dann mit Matrigel oder anderen Arten von Basismembranpolymeren beschichtet werden, oder Matrigel-ähnliche Beschichtungen für xeno-freie Kultursysteme, die in Zelltherapieanwendungen eingesetzt werden.

Zellzahl und Viabilität sind entscheidende Parameter für die Optimierung und Überwachung der Bioproduktion im großen Maßstab. Auf Microcarriern gezüchtete Zellen werden traditionell mit einem mehrstufigen Verfahren gezählt, das einen Trypsinverdau und eine Trypanblaufärbung umfasst. Diese Methode ist sowohl zeitaufwändig als auch ungenau.

Der NucleoCounter^® detektiert Zellen durch Anfärbung der Zellkerne. Sichtbar gemacht werden die Zellen mit den Fluoreszenzfarbstoffen Acridinorange (AO) zur Bestimmung der Gesamtzellzahl und 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI), die hochspezifisch für die DNA sind und Zellkerne auch in Anwesenheit von Zelltrümmern genau erkennen. Zellprobennahme, Fluoreszenzfärbung und Beladung der Zählkammern werden durch die einzigartige Via2-Cassette™-Technologie in einem einzigen Arbeitsablauf kombiniert. Die Kassetten werden in den NucleoCounter ® NC-202™ oder NC-3000™ geladen und berechnen zusammen mit den Geräten die Gesamtzellzahl und -viabilität.

Verwenden Sie den NucleoCounter^® NC-202™, wenn Sie Parameter zu Zellzahl, Lebensfähigkeit, Zellkonzentration, DebrisIndex™ und Zellaggregation benötigen. Verwenden Sie den NucleoCounter® NC-3000™, wenn Sie Zellzählungsdaten mit einem unserer Zellassays  kombinieren oder mit dem FlexiCyte™-Assay für andere Proteine von Interesse mitfärben möchten.

Eine schnellere und präzisere Methode zur Messung von Microcarrierkulturen

Die automatisierte Zellzählung mit einem NucleoCounter® ist eine genaue und zuverlässige Methode zur Messung der Zellzahl und Viabilität in Microcarrierkulturen. Das Programm des NucleoCounter^®-Gerätes verwendet einen Lyseschritt unmittelbar vor dem Zellzählschritt, der die Zellkerne schnell von den Microcarriern in Suspension bringt.

Der Bediener lädt einfach die Probe mit den freigesetzten Kernen in die Einwegkassette Via2-Cassette™, die mit Fluoreszenzfarbstoffen für die automatisierte Fluoreszenzfärbung vorgeladen ist. Das vom NucleoCounter^® erfasste Bild wird dann automatisch von einer Software verarbeitet, die die Datenerfassung, Bildanalyse und Datendarstellung übernimmt. Das gesamte Verfahren dauert weniger als fünf Minuten und kann ohne den Einsatz von Pipetten, Verdünnungen und mehrstufigen Färbeverfahren durchgeführt werden.

Ein Vergleich zwischen der traditionellen Trypsin-Verdauungsmethode und dem NucleoCounter®-Workflow zeigt, dass der NucleoCounter^® mehrere Zentrifugations-, Pipettier- und Inkubationsschritte überflüssig macht.

Verweise

1. AT Lam, AK Chen, J Li et al.: Conjoint propagation and differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes in a defined microcarrier spinner culture. 2014; Stem Cell Res Ther, Sep 15;5(5)
2. AT Lam, J Li, AK Chen et al.: Cationic surface charge combined with either vitronectin or laminin dictates the evolution of human embryonicstem cells/microcarrier aggregates and cell growth in agitated cultures. 2014; Cell Therapy, Jul 15;23(14):1688-703
3. TR Heathman, A Stolzing, C Fabian et al.: Scalability and process transfer of mesenchymal stromal cell production from monolayer to microcarrier culture using human platelet lysate. 2016; Cancer Research, Apr;18(4)
4. TR Heathman, VA Glyn, A Picken et al.: Expansion, harvest and cryopreservation of human mesenchymal stem cells in a serum-free microcarrier process. 2015; Biotechnol Bioeng, Aug;112(8)
5. AT Lam, J Li, AK Chen et al.: Improved Human Pluripotent Stem Cell Attachment and Spreading on Xeno-Free Laminin-521-Coated Microcarriers Results in Efficient Growth in Agitated Cultures. 2015; Biores Open Access, Apr 1;4(1)
6. AK Chen, X Chen, AB Choo et al.: Expansion of human embryonic stem cells on cellulose microcarriers. 2010; Curr Protoc Stem Cell Biol., Chapter 1
7. PA Marinho, DT Vareschini, IC Gomes et al.: Xeno-free production of human embryonic stem cells in stirred microcarrier systems using a novelanimal/human-component-free medium. 2013; Tissue Eng Part C Methods., Feb;19(2)
8. M Lecina, S Ting, A Choo et al.: Scalable platform for human embryonic stem cell differentiation to cardiomyocytes in suspended microcarrier cultures. 2010; Stem Cell Res Ther, Dec;16(6)