Manuell versus Automatisierte Zellzählung

Die manuelle Zellzählung ist das Standardverfahren der Zellzählung in vielen Laboren. Allerdings gibt es mehrere Probleme, wenn die Ergebnisse durch manuelle Zählung der Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer ermittelt werden. Die Zellzählung durch Bildzytometrie und automatisierte Zellzähler bietet eine Lösung für diese Fehlerquellen. Dieser Artikel präsentiert einen Überblick über manuelle versus automatisierte Zellzählverfahren.

Die NucleoCounter^®-Bildzytometer zählen Suspensionen, adhärente und aggregierte Zellen und ermöglichen somit eine schnelle und präzise Zellmessung in Situationen, in denen die Konzentrationen schwer abzuschätzen sind. Diese verbesserte Methodik bietet einen immensen Vorteil in der Präzision und Reproduzierbarkeit der Kultivierung von Säugetierzellen.

Die Zeit, die am Mikroskop verbracht wird, um Zellen zu zählen, ist mühsam und zeitaufwendig. Da Säugetierzellkulturen empfindliche Systeme sind, erfordern sie eine hohe Reproduzierbarkeit der experimentellen Parameter während des Aufbaus und der Kultur. Es ist unerlässlich, die spezifische Zellkonzentration und Viabilität einer Zellprobe zu kennen, um eine Reproduzierbarkeit bei der Subkultivierung zu erreichen, um Wachstumsraten zu überwachen oder für die Kryokonservierung^1,2.

Die manuelle Zellzählung ist jedoch oft mit großen Schwankungen bei der Berechnung der Zellkonzentration und Viabilität verbunden. Die vier größten Fehlerquellen bei der manuellen Zellzählung sind:

1. Menschliche Wahrnehmung dessen, was eine Zelle definiert
2. Volumen-, Verdünnungs- und Pipettierfehler
3. Bestimmung der Viabilität
4. Zählen von genügend Ereignissen

1. Menschliche Wahrnehmung dessen, was eine Zelle definiert

Die manuelle Definition und Erkennung einer Zelle gegenüber Zelltrümmern oder anderen Partikeln kann selbst für das geschulte Auge eine Herausforderung darstellen. Jede Person, die die manuelle Zellzählung durchführt, hält sich an bestimmte Kriterien, die eine Zelle zusammen mit dem Farbintensitätsgrenzwert definieren, um sie als lebensfähig oder tot zu zählen. Solche Abweichungen in der menschlichen Wahrnehmung können beim manuellen Zählen von Zellen beim Versuchsaufbau und bei der Auswertung äußerst nachteilig sein. Wenn mehrere Benutzer die gleiche Probe zählen, ist es nicht ungewöhnlich, dass die Varianz deutlich höher als der Mittelwert einer Poisson-Verteilung ist³.

Zellproben mit Zelltrümmern sind bei einer manuellen Zählung oft sehr schwierig korrekt zu zählen. Im Vergleich dazu sind fluoreszierende Ereignisse deutlich sichtbar.

Die Vorbereitung und Beladung der Zellprobe im Hämozytometer kann zu Fehlern führen.

Obwohl das Hämozytometer ein bestimmtes Volumen enthält, kann sich der Raum zwischen der Zählkammer und dem Deckglas leicht vergrößern, wenn die Kammer mit Flüssigkeit gefüllt ist. Dies kann zu einer Unterschätzung des Probenvolumens führen, was eine Überschätzung der Zellkonzentration zur Folge hat, was zu Fehlern führt, die auf einer falschen Schätzung des Volumens beruhen.

Volumenungenauigkeiten können auch durch Pipettieren oder durch Serienverdünnungen entstehen.

3. Bestimmung der Viabilität: Trypanblau oder DAPI?

Trypanblau färbt tote Zellen mit einer durchlässigen Zellmembran, während lebensfähige Zellen ungefärbt bleiben.

Bei der manuellen Abschätzung der Viabilität wird Trypanblau als Marker für tote Zellen verwendet. Da die Intensität der Färbung in jeder Probe variieren kann, kann es schwierig sein, festzustellen, ob eine Zelle mit Trypanblau positiv färbt.

In Anbetracht der Tatsache, dass Trypanblau für Zellen toxisch ist, werden lebensfähige Zellen schließlich angefärbt, wenn sie nicht innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens analysiert werden, normalerweise innerhalb von 5 bis 30 Minuten, je nach Probenbedingungen. Aus diesen Gründen ist bekannt, dass Trypanblau die Viabilität von Zellpopulationen unterschätzt, und bei der Interpretation der Trypanblau-basierten Viabilität ist Vorsicht geboten⁴. Daher erhöht die Auswahl eines membranundurchlässigen DNA-bindenden Farbstoffs wie 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) zur Definition toter Zellen die Präzision der Viabilitätsbestimmungen.

Die manuelle Zellzählung im Neubauer-Hämozytometer ist standardisiert auf zehn Kammern entsprechend 1 µl gezähltes Gesamtvolumen¹. Die Standardpraxis der manuellen Zellzählung besteht jedoch in der Regel darin, ~100 Zellen oder ein bestimmtes Volumen wie 0,4 µl zu zählen, unabhängig von der Konzentration der Zellen. Die Verwendung eines so geringen Volumens und einer so geringen Zellzahl erhöht den Einfluss stochastischer Variablen. Wenn nur 100 Zellen gezählt werden, beträgt die Standardabweichung aufgrund der inhärenten statistischen Einschränkungen mindestens 10 %, wobei angenommen wird, dass die Abweichung der Poisson-Verteilung folgt.

Gemäß der Poisson-Verteilung entspricht die erwartete Standardabweichung der Quadratwurzel aus der Anzahl der aufgezeichneten Ereignisse, auch ohne vom Menschen verursachte Schwankungen.

Testen Sie Ihr Verfahren zur manuellen Zellzählung

Wissen Sie, wie gut Sie und Ihre Kollegen Zellen zählen? Um Ihr Zellzählverfahren zu validieren, müssen Sie den Variationskoeffizienten zwischen den Personen untersuchen, die die manuelle Zellzählung in Ihrem Labor durchführen. Hier finden Sie ein kurzes Protokoll dazu:

1. Nehmen Sie mindestens fünf Aliquots der gleichen Zellprobe (z. B. fünf Röhrchen mit je 200 µl Probe). Die Probe vor dem Aliquotieren gründlich mischen
2. Bitten Sie fünf Kollegen, jeweils ein Aliquot zu zählen (ohne miteinander zu sprechen oder Daten auszutauschen!)
3. Zählen Sie mit Ihrem bevorzugten Hämozytometer und Ihren üblichen Zählstandards. Zählen Sie nicht mehr Quadrate oder mehr Zellen als Sie normalerweise zählen würden
4. Berechnen Sie die Zellzahl für jedes Aliquot (siehe Formel)
5. Berechnen Sie das arithmetische Mittel, die Standardabweichung und den Variationskoeffizienten in Prozent (siehe Formeln)

Ergebnisse:

• CV = 0 – 5 %: Haben Sie gemogelt? Ihre Fähigkeiten zum Zellzählen sind fortgeschritten!
• CV = 5 – 15 %: Exzellent! Sie sind ein sehr gut geübter Zellzähler
• CV = ≥ 15 %: Ihre Punktzahl ist ungefähr durchschnittlich. Bei der manuellen Zellzählung kommt es häufig zu großen Schwankungen, die zu einer Inkonsistenz der Daten zwischen den verschiedenen Versuchsanordnungen führen und sich erheblich auf die Reproduzierbarkeit Ihrer Forschungsergebnisse auswirken.

Vermeidung menschlicher Einflüsse mit der Via2-Cassette™

Die Via2-Cassette™ wurde entwickelt, um menschliche Einflüsse bei der Zellzählung zu überwinden:

• Keine menschliche Einflussnahme auf die Ergebnisse:
  Der Softwarealgorithmus definiert eine Zelle basierend auf der Acridinorange-Fluoreszenz konsistent für jede Analyse
• Pipettierfehler bei der Färbung und Handhabung von Proben werden ausgeschlossen:
  Die Kassetten sind mit immobilisiertem Acridinorange und DAPI vorgeladen, um die Gesamtzellpopulation und die Population toter Zellen zu bestimmen
• Keine menschlichen Fehler bei Berechnungen:
  Kassetten haben ein vorkalibriertes Volumen der Messkammer für präzise und reproduzierbare Ergebnisse
• Statistisch signifikante Datengenerierung:
  Das Gerät warnt Sie, wenn Sie zu wenige oder zu viele Zellen in der Probe haben

Sie können eine Zellprobe einfach in die Kassette laden, indem Sie die eingebaute Pipette in die Zellsuspension eintauchen und den Kolben drücken.

Die Via2-Cassette™ ist für die schnelle und effiziente Auszählung der Viabilität und Zellkonzentration in einem Schritt konzipiert. Acridinorange färbt die Gesamtpopulation der Zellen und tote Zellen werden mit DAPI gefärbt. Mehr erfahren.

Der von ChemoMetec entwickelte NucleoCounter^® ist das präziseste und einfach zu bedienende automatisierte Zellzählgerät⁵. Diese Bildzytometer verwenden Fluoreszenzmikroskopie zur Detektion und Analyse von Zellkulturen mit stabilen, langlebigen LED-Lichtquellen und festen Emissionsfiltern für minimale Variation. Die Probe wird mit LEDs angeregt und das Licht tritt dann durch Emissionsfiltern, die zu den Farbstoffen passen. Der Benutzer lädt die Probe, die automatisch innerhalb der Kassette gefärbt wird, bevor sie in das Gerät eingesetzt wird.

Das fokussierte und gefilterte Licht der LEDs beleuchtet das Probenfenster der Via2-Cassette™ und die eingebaute Kamera nimmt ein Bild des Fluoreszenzereignisses in der Probe auf. Anschließend analysiert der Algorithmus der Gerätesoftware die Bilder und berechnet die Ergebnisse. Die NucleoCounter^® Geräte bieten nicht nur eine Plattform zur Gewinnung hochwertiger Daten, sondern ermöglichen auch deren Sichtprüfung, da die Bilder mit der zugehörigen Gerätesoftware betrachtet werden können.

Das Licht der LEDs des NucleoCounter^® Geräts durchläuft einen Anregungsfilter, bevor es die Via2-Cassette™ durchläuft, die die Probe enthält. Hierbei emittieren an Zellen gebundene Fluorophore Licht, das fokussiert und durch einen Emissionsfilter geleitet wird, um das Signal zu verstärken. Das fokussiert emittierte Licht wird von einer Digitalkamera aufgezeichnet.

Fluorophore zur Zellzählung

Die automatisierte Zellzählung mit der Via2-Cassette™ (für NucleoCounter^® NC-202™ und NucleoCounter^® NC-200™) oder Via1-Cassette™ (NucleoCounter^® NC-202™ und NucleoCounter^® NC-3000™) basiert auf zwei spektral und biologisch unterschiedlichen Farbstoffen, die die Gesamtzellzahl und die nicht lebensfähigen Zellen definieren: Acridinorange und DAPI.

Acridinorange ist zellpermeabel und bindet vor allem Nukleinsäuren⁶, d.h. DNA in der Zelle, was es zu einem effizienten Farbstoff für die Zählung der Gesamtzellzahl macht. Nach Anregung bei 505 nm emittiert Acridinorange eine grüne Fluoreszenz mit einem Emissionsmaximum bei 525 nm.

DAPI ist eine effiziente Färbung für tote Zellen, da lebende Zellen für niedrige Konzentrationen von DAPI (einige µg pro ml) undurchlässig sind. DAPI fluoresziert blau bei Bindung an AT-reiche Cluster in der Nebenrille der doppelsträngigen DNA⁷. Nach Anregung bei 365 nm emittiert DAPI eine blaue Fluoreszenz mit maximaler Emission bei 461 nm.

Die NucleoCounter^® Geräte detektieren die Wechselwirkung zwischen Zellen und DAPI oder Acridinorange durch zwei Anregungs-LED-Lichtquellen mit Spitzenwellenlängen bei 365 nm und 505 nm. Zur Erkennung der Emission wird ein einzelner Dual-Band-Emissionsfilter von 410-460 nm und 540-650 nm verwendet.

1. MC Phelan: Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 2007; 36: 1.1.1-1.1.18.
2. RI Freshney: Basic Principles of Cell Culture. 2006; p. 1–22.
3. L Nielson, G Smyth and P Greenfield:  Hemacytometer Cell Count Distributions: Implications of Non-Poisson Behavior. Biotechnology Progress. 1991; 7(6): p. 560-563.
4. D Shah, M Naciri, P Clee et al.: NucleoCounter – An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes. Cytotechnology: 2006; 51(1): p. 39-44.
5. JR Tennant: Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability.Transplantation. 1964; 2: p. 685-94.
6. E Robbins and PI Marcus: Dynamics of Acridine Orange-Cell Interaction. I. Interrelationships of acridine orange particles and cytoplasmic reddening. J Cell Biol. 1963; 18: p. 237-50. 10.1021/bi00388a057
7. M Kubista, B Akerman and B Nordén, Characterization of interaction between DNA and 4′,6-diamidino-2-phenylindole by optical spectroscopy. Biochemistry. 1987; 26(14): p. 4545-53.