MSCs - Mesenchymale Stammzellen

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) werden in der regenerativen Medizin aufgrund ihres hohen Differenzierungspotenzials in Kombination mit einer geringen Graft-versus-Host-Disease-Reaktion eingesetzt. Die MSCs können vom zu behandelnden Patienten (autolog) oder von genetisch unterschiedlichen Patienten (allogen) stammen.

Das Interesse an der Erforschung von MSCs entstand, nachdem entdeckt wurde, dass diese Zellen in Knochen, Fett, Knorpel, Muskeln und Neuronen differenziert werden können und somit geeignete Kandidaten für regenerative Therapien wären.

Potenzielle klinische Anwendungen für die MSC-Transplantation reichen von der Geweberegeneration bis zur Therapie von Immunkrankheiten wie der Graft-versus-Host-Krankheit. Darüber hinaus sekretieren MSCs anti-apoptotische und angiogene Zytokine und Wachstumsfaktoren, die den Heilungsprozess nach Myokardinfarkt oder bei der Wundheilung unterstützen können. Wertvolle Quellen für MSCs sind Aspirate aus Knochenmark, Fettgewebe, Nabelschnurblut, Plazenta und Wharton-Sulze.

MSCs haben eine vielversprechende Zukunft in allogenen und autologen Zelltherapien, aber das Zählen dieser Zellen ist aufgrund der großen Menge an Gewebematerial eine Herausforderung. Dieses Material kann bei anderen Zellzählungsmethoden fälschlicherweise als proliferierende Zellen gezählt werden (siehe unten für weitere Erläuterungen).

Die NucleoCounter^®-Instrumente bieten eine robuste und präzise Methode zur effektiven Bestimmung der Lebensfähigkeit und Gesamtzellzahl von MSCs aus verschiedenen Quellen. Aus der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) nach einer Fettabsaugung können MSCs aus Fettgewebe isoliert werden, während eine weitere wertvolle Quelle für MSCs aus Knochenmarkaspiraten stammt.

MSCs können direkt eingesetzt oder weiter expandiert und nach Langzeitlagerung für autologe oder allogene Therapien verwendet werden. In jeder Phase der Produktion können Zellzahl und Viabilität mit NucleoCounter^®-Instrumenten zuverlässig bestimmt werden.

Die Via2-Kassette kombiniert die Zellentnahme, die Färbung und die Beladung der Zählkammer in einem Schritt und gewährleistet so Konsistenz und Robustheit zwischen verschiedenen Anwendern. Zellverarbeitende GMP-Einrichtungen können von den konsistenten Ergebnissen und der benutzerfreundlichen Technologie des NucleoCounter^®-Systems profitieren.

Zählen von aus Fettgewebe stammenden Mesenchymalen Stammzellen in Lipoaspiraten

Aus Fettgewebe stammende MSCs können in Kulturen proliferieren und lassen sich aus der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) nach Fettbiopsien und Liposuktionen isolieren. Diese Fraktion enthält eine Vielzahl von Zellen wie MSCs, Stromazellen, Endothelzellen, Adipozyten, Erythrozyten sowie Lipidtröpfchen und Mizellen. Für zelltherapeutische Anwendungen kann die SVF direkt zur Patientenbehandlung eingesetzt werden.

Für weitere Anwendungen ist es entscheidend, die Gesamtzellzahl und die Viabilität genau zu quantifizieren. Zahlreiche andere Zählverfahren sind nicht in der Lage, zwischen Zellen und Störfaktoren zu unterscheiden. Darüber hinaus verursacht eine übermäßige Menge an Zelltrümmern eine Klebrigkeit, die zu einem hohen Grad der Zellaggregation führt. Außerdem sind die aus dem Gewebe gewonnenen Aspirate nicht homogen und liefern von Anwender zu Anwender sehr unterschiedliche Ergebnisse. Um diese Probleme zu überwinden, bieten die NucleoCounter®-Instrumente ein effizientes Programm zur Bestimmung der Zellzahl und Viabilität von aus Fettgewebe stammenden MSCs.

Zur Bestimmung der Gesamtzellpopulation der SVF mit einem NucleoCounter^®-Instrument wird die Zellensuspension mit einer Lyselösung behandelt, wobei Zellen und andere membranumschlossene Partikel für die Zellkernfärbung mit DAPI unter Verwendung der Via2-Cassette^® lysiert werden. Im zweiten Schritt werden die toten Zellen mit DAPI angefärbt, ohne dass eine Vorbehandlung erforderlich ist.

Aufgrund der Spezifität der DAPI-Bindung an DNA zählen die NucleoCounter^® Geräte nur die Zellen, die nukleäre DNA enthalten. Daher vernachlässigen sie Artefakte, die häufig in der SVF beobachtet werden und die genaue Messung stören, wie z. B. Zellfragmente, Mizellen, Mikrovesikel, Fetttröpfchen. Dazu gehören auch Zellen ohne DNA-Inhalt wie Erythrozyten und Thrombozyten.

Zählen von aus Knochenmark stammenden MSCs

Zur Isolierung von aus dem Knochenmark stammenden MSCs werden Knochenmarksbiopsien oder -aspirate entnommen. Die Bestimmung der Zellzahl und Viabilität von MSCs direkt aus Knochenmarksproben ist eine besondere Herausforderung, da diese große Mengen an Erythrozyten enthalten, die herkömmliche automatische und manuelle Zählmethoden stören.

In einigen Fällen, in denen das Verhältnis von Erythrozyten zu kernhaltigen Blutzellen einen bestimmten Grenzwert überschreitet, kann es ratsam sein, die Erythrozyten zu lysieren.

Um MSCs direkt in Knochenmarkaspiraten einfach und zuverlässig zu zählen, bieten die NucleoCounter®-Instrumente ein schnelles Programm zur Behandlung der Erythrozyten in der Probe. Erythrozyten werden durch Zugabe von Blut-Lysepuffer zum Knochenmarkaspirat und kurzzeitige Inkubation lysiert.

Die benutzerfreundliche Software, die einem NucleoCounter^® beiliegt, bestimmt automatisch die Zellviabilität, die Gesamtzahl, die Lebendzahl und die Totzahl. Mit NC-View™ können Sie das Fluoreszenzbild prüfen und die Zählung verifizieren.

Die automatisierten Zellzahlmessgeräte sind für den Einsatz in GMP-Einrichtungen geeignet, die die Vorschriften des 21 CFR Part 11 anwenden.

Mit ihrem All-in-One-Workflow und der integrierten Pipette sorgt die einzigartige Via2-Cassette™ für eine konsistente Zellentnahme und eliminiert Produktionsschwankungen zwischen den Anwendern. Zusätzlich sind die Kassetten individuell volumenkalibriert, um eine möglichst genaue Berechnung der Zellzahl zu ermöglichen. Aufgrund ihres Designs vermeiden die Kassetten menschliche Fehler, die sonst durch das Mischen von Reagenzien und das Einladen von Proben entstehen. Dies führt zu einer präzisen und reproduzierbaren Zellzahl, die die Trypanblau-Ausschlussmethode weit übertrifft.