Ein Vergleich der DNA-Quantifizierung im Zellzyklus

Der gebräuchlichste Ansatz zur Bestimmung des Zellzyklus basiert auf der Quantifizierung des zellulären Gehalts an DNA, der mit fluoreszierenden DNA-spezifischen Färbungen bestimmt werden kann, die Emissionssignale proportional zur DNA-Masse aufweisen. Die DNA-Färbung wird typischerweise an Zellen durchgeführt, die entweder mit nichtionischen Detergenzien greinigt oder mit Alkohol fixiert wurden. Traditionell ist die Durchflusszytometrie die Standardmethode der Wahl für die Durchführung von Zellzyklusanalysen.

Der Zellzyklus stellt den grundlegendsten und wichtigsten Prozess in eukaryontischen Zellen dar. Als geordnete Abfolge von Ereignissen, die in Zellwachstum und der Teilung in zwei Tochterzellen gipfelt, wird der Zellzyklus durch eine definierte zeitliche und räumliche Expression, Lokalisierung und Abbau mehrerer Zellzyklusregulatoren streng reguliert. Cycline und Cyclin-abhängige Kinasen (CDK) sind wichtige Kontrollschalter für den Zellzyklus, die dafür sorgen, dass sich die Zelle von der G1- zur S- oder von der G2- zur M-Phase bewegt.

In jeder Population verteilen sich die Zellen auf drei Hauptphasen des Zellzyklus: G1/G0-Phase (ein Satz gepaarter Chromosomen pro Zelle), S-Phase (DNA-Synthese mit einer variablen Menge an DNA) und G2/M-Phase (zwei Sätze gepaarter Chromosomen pro Zelle, vor der Zellteilung).
Es gibt einige Möglichkeiten, die Progression und Regulation des Zellzyklus zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine Vergleichsstudie zwischen Bild- und Durchflusszytometrie unter Verwendung von Zellen, die entweder durch Alkohol-Fixierung oder Säure-Lyse permeabilisiert wurden.

Exponentiell wachsende Jurkat-, CHO- und U2OS-Zellen wurden durch Alkoholfixierung permeabilisiert, mit DAPI angefärbt und mittels Durchflusszytometrie (obere Reihe) und Bildzytometrie (untere Reihe) auf den DNA-Gehalt analysiert. Die erfassten Daten wurden wie im Abschnitt „Methoden“ des Poster-PDF beschrieben ausgewertet. Die grünen, gelben und cyanfarbenen Bereiche der Histogramme stellen G1-, S- bzw. G2/M-Zellen dar.

Für alle drei Zelllinien ähneln die mit dem Bildzytometer erhaltenen Histogramme des DNA-Gehalts denen, die mit dem Durchflusszytometer aufgenommen wurden. In allen Fällen zeigen die Histogramme schmale G1-Peaks mit niedrigem Varianzkoeffizienten (CV).

Siehe Vollständigen Datensatz im PDF-Poster

Fazit

Die Dysregulation des Zellzyklus ist ein ausgeprägtes Merkmal von Krebszellen und zahlreiche Chemotherapeutika zielen auf die Zellzyklusprogression ab. Um zuverlässige Zellzyklusanalysen durchzuführen und genomische Anomalien, wie z. B. Aneuploidie, zu erkennen, werden Systeme benötigt, die eine genaue und präzise Quantifizierung des DNA-Gehalts ermöglichen. Derzeit ist die Durchflusszytometrie der Goldstandard für die Quantifizierung des Zellgehalts an DNA.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass der NucleoCounter^® NC-3000™ im Vergleich zum BD LSR II eine hohe Genauigkeit und Präzision bei der Quantifizierung des Zellgehalts von DNA aufweist. So fanden wir ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen den Zellzyklusverteilungen, die von den beiden zytometrischen Systemen gemessen wurden.

Außerdem haben wir zwei verschiedene Methoden zur Permeabilisierung von Zellen vor der DNA-Färbung verglichen: Konventionelle Alkoholfixierung und eine Kombination aus milder Säure und nichtionischem Reinigungsmittel. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die neue Säure-Lyse-Methode eine genaue Quantifizierung des DNA-Gehalts ermöglicht. Im Allgemeinen lieferten mit Säure lysierte Zellen einen geringeren Variationskoeffizienten (CV) des G1-Peaks als alkoholfixierte Zellen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Quantifizierung von Zellzyklusverteilungen mittels Bildzytometrie im Vergleich zur Durchflusszytometrie genau und präzise ist, mit den Vorteilen der Kosteneffizienz, der Zuverlässigkeit und der Möglichkeit zur morphologischen Bestätigung der gemessenen Objekte.

Olaf Nielsen, Anna Fossum und Soren Kjaerulff.